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九香蟲油脂提取條件優化及體外抗乳腺癌活性研究

發布日期:2022-04-06 20:24來源:中國油脂作者:于姮梅等(lkmoo上點擊次數:

 昆蟲是地球上最大的生物類群,具有種類多、數量大、繁殖速度快等特點,長期以來被人類作為食品、藥品和化學原料利用[1],其主要應用價值來自其體內豐富的蛋白質、油脂、碳水化合物等有機物質及多種無機物質[2]。昆蟲因其油脂含量豐富、脂肪酸組成合理,是潛在的優質食用油脂源[3]。此外,昆蟲油脂具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、改善記憶力、保護肝臟、預防心血管疾病等多種藥理活性[4-10],如:美洲大蠊和絲光綠蠅油脂具有良好的抗氧化活性[4];大頭金蠅幼蟲油脂具有護肝和降血脂的功效[5-6];黃粉蟲油脂能夠抑制小鼠增重,提高學習記憶力[7];蠶蛹油脂具有降血脂、降血糖、抗氧化、改善記憶力、保護肝臟、預防心血管疾病等功效[8-10]。上述諸多研究為昆蟲油脂藥理活性的深入探索提供了有力的支持。 九香蟲(Aspongopus chinensis Dallas,1851)是我國傳統的藥食兩用資源昆蟲,是我國部分地區傳統的特色食品,同時現代醫學證明其具有良好的抗癌功能[11-13]。九香蟲油脂含量豐富[14-15],李會芳等[16-17]采用正交實驗對超臨界CO2和石油醚回流提取九香蟲油脂的工藝條件進行了優化,但總體來說,對九香蟲油脂提取方法的研究還比較少。另外,對九香蟲油脂相關藥理的研究還比較缺乏?;诖?,本研究采用索氏抽提法提取九香蟲油脂,以油脂提取率為考察指標,以液料比、提取溫度、提取時間為影響因素,采用單因素實驗和正交實驗對九香蟲油脂的提取工藝進行了優化,以確定九香蟲油脂的最佳提取條件;并以小鼠乳腺癌細胞4T1和人乳腺癌細胞HCC1937為研究對象,通過體外實驗驗證所提取九香蟲油脂的抗乳腺癌活性,以期為九香蟲油脂的高效提取及藥用價值的深入挖掘提供參考。
     1材料與方法
     1.1實驗材料
     1.1.1蟲源及細胞來源 九香蟲成蟲,采自貴州省凱里市(東經10780°,北緯26.52°),洗凈并用吸水紙吸干蟲體表面水分,置于-80 ℃冰箱儲存備用。小鼠乳腺癌細胞系4T1和人乳腺癌細胞系HCC1937,中科院上海細胞庫。
     1.1.2主要試劑 石油醚(沸程60~90 ℃,分析純),天津富宇精細化工有限公司;RPMI-1640培養基、丙酮酸鈉溶液,美國Gibco公司;胎牛血清,杭州四季青公司;青霉素-鏈霉素溶液,北京索萊寶科技有限公司;碳酸氫鈉(分析純),天津市永大化學試劑有限公司;葡萄糖(分析純),成都金山化學試劑有限公司;025%胰蛋白酶,美國HyClone公司;PBS緩沖液,上海生工生物工程股份有限公司;CCK-8細胞增殖檢測試劑盒,漢恒生物科技有限公司;無水乙醇(分析純),重慶川東化工有限公司。
     1.1.3主要儀器 Forma 900 series超低溫冰箱、FORM3141型二氧化碳培養箱、Multislan GO酶聯免疫檢測儀,美國Thermo Fisher Scientific公司;202型電熱恒溫干燥箱,北京永光明醫療儀器廠;JYS-M01磨粉機,九陽股份有限公司;BSM型電子天平,上海卓精電子科技有限公司;SZF-06A脂肪測定儀,上海昕瑞儀表有限公司;RE-52A旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;Bio-Ⅱ-A/M生物安全柜,西班牙Telstar公司;IC1000自動細胞計數儀,上海睿鈺生物科技有限公司;AE20/21倒置相差顯微鏡,廈門麥克奧迪公司;Eppendorf移液器;Millex GP過濾器(0.22 μm),美國密理博公司。

         1.2實驗方法
    1.2.1九香蟲油脂的提取 取九香蟲于65 ℃烘箱中烘干4 h,用磨粉機粉碎。稱取5.0 g九香蟲粉,用濾紙筒包裹后置于脂肪測定儀抽提器中,加入石油醚提取一定時間,旋轉蒸發儀旋蒸回收溶劑后,置于50 ℃電熱恒溫干燥箱中烘干至恒重,得到九香蟲油脂。按下式計算九香蟲油脂提取率(Y)。 

Y=m1/m0×100%(1)

 式中:m1為九香蟲油脂質量,g;m0為九香蟲粉質量,g。

     1.2.2九香蟲油脂對乳腺癌細胞的影響
     1.2.2.1細胞培養及油脂預處理 小鼠乳腺癌細胞4T1與人乳腺癌細胞HCC1937于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養,待細胞生長至培養瓶底70%~80%滿時進入對數生長期,待用。 九香蟲油脂和無水乙醇分別用0.22 μm過濾器過濾除菌備用。
     1.2.2.2形態學觀察 取對數生長期的小鼠乳腺癌細胞4T1、人乳腺癌細胞HCC1937,用0.25%胰酶消化后,采用細胞計數器計數,調整細胞濃度至5×104個/mL(細胞懸液)。分別取100 μL細胞懸液接種于96孔培養板中,待24 h細胞貼壁后,加入九香蟲油脂至終質量濃度分別為0、8、16 mg/mL(均含1%無水乙醇),另設置陰性對照組(不含無水乙醇的完全培養液),24 h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。
     1.2.2.3CCK-8法檢測九香蟲油脂對乳腺癌細胞增殖作用的影響 細胞前期處理同1.2.2.2,實驗設置空白對照組(不加入細胞)。待24 h細胞貼壁后,加入九香蟲油脂至終質量濃度分別為0、4、8、12、16 mg/mL(均含1%無水乙醇),另設置陰性對照組(不含無水乙醇的完全培養液),每組設置6個重復。24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,置于細胞培養箱中繼續培養,4 h后使用酶標儀檢測450 nm下吸光度(A),按式(2)計算細胞增殖率(Y1),并利用GraphPad Prism 8.0軟件計算九香蟲油脂對乳腺癌細胞4T1、HCC1937的半抑制濃度(IC50)。

 Y1=(A1-A0)/(A2-A0)×100%(2) 

式中:A1為實驗組的吸光度;A0為空白對照組的吸光度;A2為陰性對照組的吸光度。

    1.2.3數據處理 實驗數據應用統計軟件SPSS 19.0進行單因素方差分析,所有數據用“x±s”表示,P<0.05為差異有統計學意義。
    2結果與討論
    2.1九香蟲油脂提取單因素實驗
    2.1.1液料比的影響 在提取溫度70 ℃、提取時間3 h條件下,考察不同液料比對九香蟲油脂提取率的影響,結果見圖1。


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由圖1可見,隨著液料比的增大,九香蟲油脂提取率先逐漸上升后趨于穩定,在液料比為(6~8)∶ 1時,油脂提取率上升幅度不明顯??紤]到有機溶劑用量過大,會導致后續旋蒸、揮發有機溶劑等工作量的增加,生產成本增加,故選取液料比6∶ 1為較優的提取條件用于后續實驗。
   2.1.2提取時間的影響 

在液料比6∶ 1、提取溫度70 ℃條件下,考察不同提取時間對九香蟲油脂提取率的影響,結果見圖2。 由圖2可見,九香蟲油脂提取率隨提取時間的延長先逐漸上升后趨于穩定。在提取時間為3~5 h時,油脂提取率變化不明顯,且5 h時油脂提取率較4 h時略有降低,可能是由于提取時間過長九香蟲蛋白質對九香蟲油脂的反吸附所致[18]。從節約資源的角度出發,初步確定提取時間3 h為較優的提取條件用于后續實驗。

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2.1.3提取溫度的影響 在液料比6∶ 1、提取時間3 h條件下,考察不同提取溫度對九香蟲油脂提取率的影響,結果見圖3。

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由圖3可見,60 ℃以下,由于提取溫度過低未達到石油醚沸點而導致九香蟲油脂提取率過低,隨后隨提取溫度的升高油脂提取率逐漸上升,80 ℃以上時提取溫度對油脂提取率無明顯影響。因此,選取 提取溫度80 ℃為 較優的提取條件用于后續實驗。
  2.2九香蟲油脂提取的正交實驗 在單因素實驗的基礎上,以九香蟲油脂提取率為考察指標,以液料比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)三個因素設計三因素三水平的正交實驗,正交實驗因素水平見表1,正交實驗設計與結果見表2(每組實驗進行3次重復)。

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由表2可知,提取溫度對九香蟲油脂提取率的影響最大,各因素的影響主次順序為提取溫度>液料比>提取時間,且最佳提取條件為A2B3C2,即液料比6∶ 1、提取溫度90 ℃、提取時間3 h。在最佳條件下進行4次驗證實驗,九香蟲油脂提取率分別為45.565%、42.686%、42.960%、45.869%,平均為(44.270±1.679)%。 實際應用中可根據需要適當調整提取條件,考慮到實際生產中溫度過高可能會破壞油脂結構而影響油脂品質(有待進一步驗證),建議提取溫度為75~80 ℃。

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2.3九香蟲油脂作用下乳腺癌細胞形態學變化 九香蟲油脂對小鼠乳腺癌細胞4T1與人乳腺癌細胞HCC1937形態的影響見圖4。
    

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由圖4可見:與陰性對照組相比,1%無水乙醇作用24 h,對兩種細胞的細胞形態及細胞密度均無明顯影響,證實其作為有機溶劑溶解油脂的同時不會對細胞造成損傷;8 mg/mL九香蟲油脂作用24 h,貼壁細胞數量明顯減少,且部分細胞發生皺縮;16 mg/mL九香蟲油脂作用24 h,細胞皺縮程度更為明顯。結果說明九香蟲油脂對兩種乳腺癌細胞造成損傷,導致細胞貼壁能力減弱并發生皺縮。
   2.4九香蟲油脂對乳腺癌細胞增殖抑制作用 不同質量濃度九香蟲油脂處理對小鼠乳腺癌細胞4T1和人乳腺癌細胞HCC1937增殖的影響結果見圖5。

    

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由圖5可見,與陰性對照組相比,1%無水乙醇處理24 h對兩種細胞增殖率無顯著影響(4T1、HCC1937細胞增殖率分別為(99.390±0.007)%、(99.910±0.025)%),證實其作為有機溶劑溶解油脂的同時不會對細胞增殖率造成明顯影響。 由圖5(a)可見,與陰性對照組相比,4、8 mg/mL九香蟲油脂處理小鼠乳腺癌細胞4T1 24 h,細胞增殖率(分別為(97.351±0.005)%、(95.826±0.004)%)無顯著變化,而12、16 mg/mL九香蟲油脂處理小鼠乳腺癌細胞4T1 24 h,細胞增殖率極顯著降低(分別為(26.275±0.061)%、(2.129±0.004)%)。由圖5(b)可見,與陰性對照組相比,4、8、12、16 mg/mL九香蟲油脂處理人乳腺癌細胞HCC1937 24 h,細胞增殖率極顯著降低(分別為(89130±0.043)%、(89.150±0.060)%、(17.540±0.039)%、(0.500±0.001)%)。九香蟲油脂作用于小鼠乳腺癌細胞4T1、人乳腺癌細胞HCC1937 24 h 的半抑制濃度(IC50)分別為10.850、10.100 mg/mL。本研究證明九香蟲油脂具有良好的抗乳腺癌活性,能夠改變細胞形態并顯著抑制其增殖,這可能與九香蟲油脂中含奇數碳脂肪酸相關[19],有報道稱昆蟲油脂中含有的奇數碳脂肪酸具有特殊的生理活性,如抗癌活性等[2,20]。
     3結論 

   采用索氏抽提法提取九香蟲油脂,通過單因素實驗和正交實驗對提取九香蟲油脂的工藝條件進行優化,得到最優提取條件為液料比6∶ 1、提取溫度90 ℃、提取時間3 h,此條件下九香蟲油脂提取率為(44.270±1.679)%。CCK-8法細胞增殖抑制實驗結果表明,九香蟲油脂能夠顯著抑制小鼠乳腺癌細胞4T1、人乳腺癌細胞HCC1937體外增殖,并能夠改變細胞形態,導致細胞皺縮,細胞數量減少。
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