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復合誘變皮狀絲孢酵母選育高產油脂菌株

發布日期:2018-10-15 16:05來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 李新社1,2,易自力1,陸步詩2,唐鵬程2 

 

(1.湖南農業大學 生物科學技術學院, 長沙 410128; 2. 邵陽學院 生物與化學工程系,湖南 邵陽 422000)

 

摘要:采用紫外線與硫酸二乙酯對皮狀絲孢酵母進行復合誘變。研究結果表明:用15 W紫外燈在照射距離30 cm條件下照射60 s,可以篩選到油脂含量30.4%,生物量1.135 4 g/100 mL的突變菌株皮- 60;利用硫酸二乙酯誘變皮-60,在硫酸二乙酯質量分數1.0%,處理時間為70 min條件下,可以篩選到油脂含量35.7%,生物量1.257 3 g/100 mL的突變菌株皮-60-70,較出發菌株,油脂含量提高了33.7%。

關鍵詞:皮狀絲孢酵母;紫外線;硫酸二乙酯;復合誘變;微生物油脂

中圖分類號:TQ642;TQ92   文獻標志碼:A   文章編號:1003-7969(2010)07-0031-04

 

Screening of high oil yielding strain by compound 

mutation of Trichosporon cutaneum

LI Xinshe1,2, YI Zili1,LU Bushi2,TANG Pengcheng2

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128,

China; 2.Department of Biology and Chemistry Engineering,Shaoyang University, 

Shaoyang 422000,Hunan,China)

 

Abstract:Compound mutation of Trichosporon cutaneum with UV and diethyl sulfate(DES) was studied.The result indicated that when the UV lamp was 15W, the irradiation distance was 30 cm and the irradiation time was 60 s, the mutation strain of pi-60 with 30.4% of oil content and 1.135 4 g/100 mL of biomass could be selected. When the DES was applied to the strain pi-60, and the mutation strain (pi-60-70) with 35.7% of oil content and 1.257 3 g/100 mL of biomass could be selected by treating for 70 min with 1.0% DES. Compared with the original strain ,the oil content of the strain pi-60-70 increased by 33.7% .

Key words:Trichosporon cutaneum; UV; DES; compound mutation; microbial oil

    隨著日益嚴重的全球性能源短缺與環境惡化,控制汽車尾氣排放,保護人類賴以生存的自然環境成為目前人類急需解決的問題。世界各國的能源研究人員從環境保護和資源的戰略角度出發,積極探索發展替代燃料及可再生能源,生物柴油就是其中一種。生物柴油是指以植物油、動物脂肪等可再生資源生產的可用于壓燃式發動機的清潔替代燃油[1],其突出的環保性和可再生性,引起了世界發達國家,尤其是資源貧乏國家的高度重視。目前,生物柴油多是利用菜籽油、大豆油、回收烹飪油、動物油等為原料制成,這些原料可能受到場地、季節、氣候等環境因素及原料來源的影響,因而經濟可行性差。

    微生物油脂又稱單細胞油脂(Single cell oil,SCO),是酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定的條件下,以碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源,在菌體內產生的油脂。開發微生物油脂,具有發酵周期短,不受場地、季節、氣候影響的優勢。美國國家可再生能源試驗室(NREL)曾在報告中指出,微生物油脂是生物柴油產業和生物經濟的重要研究方向[2]。本試驗利用紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)復合誘變皮狀絲孢酵母,以篩選高產油脂菌株,為農產品廢料轉化油脂提供生產菌,為生物柴油開發提供原料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 皮狀絲孢酵母(GIM 2.68 Trichosporon cutaneum):由廣東微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.1.2 麥芽汁培養基 由湖南邵陽市百惠啤酒廠提供。

1.1.3 試劑 硫酸二乙酯、瓊脂、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蘇丹黑、二甲苯、沙黃、氯仿、甲醇、無水乙醇等均為市售分析純。

1.1.4 儀器設備 紫外可見分光光度計,恒溫培養箱,冰箱,超凈工作臺,立式高壓蒸汽鍋,恒溫水浴箱,離心機,顯微鏡,糖度計,電子分析天平,紫外燈等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的制備 取1 kg大麥粉,加入55~60 ℃溫水4 kg左右,在55~60 ℃水浴鍋中保溫糖化3~4 h,至液體中加碘無淀粉反應為止。先用紗布過濾,煮沸20 min后分別用定性和定量濾紙各過濾1次,調節含糖量約18 g/100 mL(糖度10 ° Bé),固體培養基的瓊脂添加量為1.5%~2.0%。分裝后加棉塞并包扎好,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[3]。

1.2.2 菌種的活化與擴大培養 在無菌條件下取少量菌種接種至試管斜面培養基上,28 ℃恒溫培養2 d。將菌種活化2~3次。將已活化好的斜面培養基中的菌苔刮到100 mL、pH 7.0的無菌磷酸鹽緩沖溶液中,充分搖勻后分別移取2 mL至新鮮的液體培養基中,28 ℃恒溫振蕩培養2 d。

1.2.3 生長曲線的繪制 取25支20 mL試管,分別裝等量(10.0 mL)同種麥芽汁液體培養基滅菌備用。用移液管向每只試管中移取經過充分搖勻含皮狀絲孢酵母的培養基0.5 mL,放入搖床發酵培養箱中28 ℃恒溫培養。每2 h從培養箱中取出1支試管并且編號放入冰箱冷藏。待所有試管全部拿出時,在600 nm的波長下用紫外可見分光光度計進行檢測并記錄吸光度。以培養時間為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制皮狀絲孢酵母的生長曲線[4]。

1.2.4 生物量與油脂含量的測定 取活化后的菌種,將斜面培養基上的菌苔刮到pH 7.0的無菌磷酸鹽緩沖溶液中,充分搖勻后分別吸取2.0 mL移接到6瓶100.0 mL的液體培養基中,28 ℃恒溫培養2 d。取出1瓶置于離心管中在4 500 r/min下離心10 min,收集上清液干燥(干燥溫度80 ℃)至恒重,用電子分析天平精確稱取干菌體質量,做平行試驗3次。另取1瓶分別用凍融法和超聲波粉碎法使細胞破裂,然后在4 000 r/min下離心15 min取上清液。再添加適量(約40.0 mL)鹽酸水解,室溫下靜置20 min,再用沸水浴加熱10 min,加入適量(約50.0 mL)氯仿-甲醇溶液(2∶ 1),振蕩30 min,置于500 mL分液漏斗中分液,取氯仿層,真空干燥除去氯仿即得油脂,用電子天平精確稱取油脂質量[5],做平行試驗3次。生物量為1000 mL菌液中干菌體的質量,油脂質量為1000 mL菌液中提取所得油脂的質量;油脂含量以油脂質量占干菌體質量的百分比表示。

1.2.5 致死曲線的繪制 將皮狀絲孢酵母活化2 d后移入液體培養基中擴大培養,取對數生長期的菌種, 用pH 7.0的無菌磷酸鹽緩沖溶液調節菌液濃度為108個/mL。打開紫外燈(15 W)預熱20 min,在直徑9 cm的無菌平皿中注入10.0 mL菌液,在磁力攪拌器作用下于紫外燈下(15 W、30 cm) 分別照射0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 s,暗箱保藏2~3 h,在紅燈下分別稀釋10倍、100倍后各取0.10 mL菌液進行平板涂布,28 ℃恒溫培養2 d,統計平板上菌落個數。以照射0 s菌液為對照,計算致死率并繪制紫外線致死曲線[6]。選取致死率為80%左右的誘變時間作為最佳處理時間。將經紫外線誘變選育出的突變菌株進行活化,用pH 7.0的無菌磷酸鹽緩沖溶液洗脫并稀釋獲得菌液濃度為108個/mL的菌懸液。取20.0 mL于三角瓶中,加入質量分數為1.0%的硫酸二乙酯溶液1 mL,置于28 ℃水浴中分別振蕩處理10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min后,速加過量硫代硫酸鈉溶液(約5.0 mL)中止反應。各取菌液0.10 mL,均勻涂布于麥芽汁平板培養基上,28 ℃培養2 d。以平板菌落計數法進行活菌計數,繪制硫酸二乙酯致死曲線圖[7]。選取硫酸二乙酯致死率為80%左右的處理時間作為硫酸二乙酯誘變劑量進行試驗。

1.2.6 突變菌株的初篩 將在最佳誘變條件下誘變后的菌株在平板上進行涂布、培養,挑取菌落較大且菌落形態與出發菌株的菌落形態有明顯不同的菌落進行涂片,用蘇丹黑染色15 min,95%的乙醇沖洗,洗脫至無色再用沙黃復染,水洗,風干后鏡檢。在顯微鏡下菌絲呈紅色,菌體內的脂肪顆粒呈藍黑色[8],選取油脂含量高的突變菌落進行復篩。

1.2.7 突變菌株的復篩 將初篩后的突變菌株用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液調節至相同菌液濃度,取2.0 mL接種到100.0 mL液體培養基中,28 ℃恒溫振蕩培養2 d。通過檢測生物量與油脂含量,選出油脂含量最高的菌株,通過連續傳代,選育性能穩定的菌株保藏。

2 結果與分析

2.1 皮狀絲孢酵母生長曲線的繪制 

    將皮狀絲孢酵母活化后,接種在麥芽汁培養基中,28 ℃恒溫培養,每2 h取樣在600 nm波長下用紫外可見分光光度計進行檢測并記錄吸光度,以培養時間為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制皮狀絲孢酵母生長曲線(見圖1)。

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圖1 皮狀絲孢酵母生長曲線

    由圖1可以看出,皮狀絲孢酵母的1個生長周期為34 h,從開始培養至12 h為適應期,12~20 h為對數生長期,20~28 h為穩定生長期,28~34 h為衰亡期。選取培養14 h后的皮狀絲孢酵母作為誘變出發菌株。

2.2 紫外線誘變結果

2.2.1 皮狀絲孢酵母的紫外線致死曲線 將出發菌株在紫外線下照射不同時間,通過平板活菌計數法計數照射后的活細胞含量,計算致死率。以照射時間為橫坐標,致死率為縱坐標繪制致死曲線(見圖2)。

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圖2 皮狀絲孢酵母紫外線致死曲線

    圖2結果表明, 經過紫外線照射50、60、70 s后皮狀絲孢酵母的致死率分別為74.3%、82.5%、89.3%。選取致死率為70%~80%的紫外線照射時間為最佳處理時間進行誘變。

2.2.2 紫外線誘變對皮狀絲孢酵母的影響 對誘變后在平板上長出的突變菌株用蘇丹黑染色,選取油脂含量高的突變菌株進行干菌體質量和油脂質量檢測,結果見表1。

表1 出發菌株和紫外線正突變菌株干菌體

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    由表1可看出,5號菌株的油脂含量為30.4%,較出發菌株油脂含量提高了13.86%,干菌體質量為1.135 4 g,將其命名為皮- 60。

2.3 硫酸二乙酯誘變結果

2.3.1 皮狀絲孢酵母的硫酸二乙酯致死曲線 在28 ℃水浴中對皮- 60用硫酸二乙酯處理不同時間后,涂布于麥芽汁固體培養基平板上, 28 ℃恒溫培養2 d后, 以平板菌落計數法計算活菌數,統計致死率。以處理時間為橫坐標,致死率為縱坐標繪制硫酸二乙酯致死曲線,結果見圖3。

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圖3 1.0%的硫酸二乙酯處理皮- 60的致死曲線

    圖3結果表明, 經過硫酸二乙酯處理60、70、80 min后皮-60的致死率別為72.6%、813%和89.5%。

2.3.2 正交試驗確定硫酸二乙酯誘變參數 以硫酸二乙酯的質量分數和處理時間為變量,進行2因素3水平正交試驗(見表2)[9],對各試驗組致死率與正突變率進行檢測,結果見表3。

表2 正交試驗因素水平

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表3 致死率和正突變率試驗結果

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    表3的試驗結果表明, A2B2為最佳組合,即硫酸二乙酯質量分數為1.0%, 處理時間為70 min。

2.3.3 復合誘變正突變菌株的篩選 將活化后的皮-60在28 ℃水浴下用質量分數1.0%的硫酸二乙酯振蕩處理70 min , 速加過量硫代硫酸鈉溶液中止反應, 取0.10 mL誘變后的菌液均勻涂布于麥芽汁固體培養基上, 28 ℃恒溫培養2 d。挑選平板上可疑的變異菌落用蘇丹黑進行染色,選取顏色較深的10個菌落作為突變菌株,28 ℃恒溫振蕩培養2 d后檢測其干菌體質量和油脂質量, 結果見表4。

表4 正突變菌株的干菌體質量和油脂質量檢測結果

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    由表4可看出,3號菌株干菌體質量、油脂質量最大,且油脂含量高達35.7%,產脂性能最強, 較出發菌株油脂含量提高了33.7%。將其命名為皮-60-70。

2.3.4 出發菌株與突變菌株油脂含量對比 將出發菌株、皮-60、皮-60-70在相同條件下培養后進行油脂含量檢測,結果見表5。

 表5 正突變菌株油脂含量與出發菌株油脂含量對比  %

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    由表5可知,出發菌株的油脂含量為26.7%,通過紫外線誘變后,篩選到的突變菌株油脂含量提高到30.4%,再用硫酸二乙酯處理紫外線突變菌株,可以篩選到油脂含量提高到35.7%的突變菌株。

3 結 論

    用15 W紫外燈在照射距離為30 cm條件下照射皮狀絲孢酵母60 s,可以篩選到油脂含量304%,生物量1.135 4 g/100 mL的突變菌株皮-60;利用硫酸二乙酯誘變皮-60,在硫酸二乙酯質量分數1.0%,處理時間70 min條件下,可以篩選到油脂含量35.7%,生物量1.257 3 g/100 mL的突變菌株皮-60-70,較出發菌株,油脂含量提高了33.7%。如果采用基因工程、原生質融合等技術對菌種進行改良,或者對篩選到的突變菌株進行最佳培養基探討及發酵條件優化,油脂產量會有進一步提高。

參考文獻:

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[9] 趙超敏,車振明.工業有益微生物育種技術的研究進展[J].食品研究與開發, 2008,29(2):172-174.

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