您好,歡迎來到中國油脂網 !
微信公眾號
微信公眾號
手機版
手機版

高效降解棉酚菌種的篩選及棉粕發酵脫毒工藝研究

發布日期:2018-06-15 10:28來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 朱德偉1,2,劉志鵬2,蔡國林2,曹 鈺2,王興國3,陸 健1,2

(1.  江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122; 2.江南大學 生物工程學院,
江蘇 無錫 214122; 3. 江南大學 食品學院,江蘇 無錫 214122)

摘要:通過醋酸棉酚YPG培養基多級逐步馴化篩選,結合棉粕固態生物發酵的方法,篩選出1株高效降解棉酚的熱帶假絲酵母JD-9。通過單因素試驗初步確定了棉粕發酵脫毒的工藝條件,進一步利用分式析因試驗設計法,對影響棉粕脫毒率的因素進行了篩選,方差分析表明,影響棉粕發酵脫毒的主要因素為熱帶假絲酵母JD-9接種量和卡氏酵母JD-13接種量。通過響應面分析法和典型性分析得出棉粕發酵脫毒的最優條件為:熱帶假絲酵母JD-9接種量4.42%,卡氏酵母JD-13接種量0.56%,發酵時間48 h,發酵溫度30 ℃,料水比1∶ 0.8,棉粕中的棉酚從987.5 mg/kg降解至85.9 mg/kg,脫毒率達到91.3%。
    關鍵詞:棉粕;棉酚;脫毒;發酵
    中圖分類號TS229;S816    文獻標志碼:A    文章編號:1003-7969(2010)02-0024-05


Screening of gossypol-degrading strain and its application
in fermentation of cottonseed meal

ZHU Dewei1,2,LIU Zhipeng2,CAI Guolin2,CAO Yu2,
WANG Xingguo3,LU Jian1,2
(1.Key Lab of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,
Jiangsu,China; 2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China;
3. School of Food Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China)

 

Abstract:The YPG medium containing acetic gossypol was used for the gossypol-degrading strain screening.A strain of Candida tropicalis JD-9 with high efficiency of gossypol-degrading was screened out.The methods of single factor experiments,fractional factorial experimental design and central composite experimental design were used to optimize the process parameters for detoxification of gossypol in cottonseed meal by Candida tropicalis JD-9 during solid substrate fermentation.The optimum fermentation conditions were as follows:inoculums level of JD-9(Candida tropicalis)4.42%,inoculums level of JD-13(S.carlsbergensis)0.56%,incubation time 48 h,incubation temperature 30 ℃,ratio of material to water 1∶ 0.8.Under the optimum conditions,the content of gossypol reduced from 987.5 mg/kg to 85.9 mg/kg,and the detoxification efficiency was up to 91.3%. 
    Key words:cottonseed meal;gossypol;detoxification;fermentation

棉粕是豐富的蛋白來源,含粗蛋白40%左右,粗纖維約11%,此外B族維生素、硫胺素和有機磷也較多,是重要的蛋白質飼料資源。我國是一個產棉大國,每年可生產600多萬t棉粕,在我國餅粕類飼料原料中,其產量僅次于大豆粕,而使用量僅為30%,飼料工業的發展目標為:到2010、2020年力爭使棉粕飼用比例提高到80%和85%[1]。但由于棉粕含有有毒物質棉酚(700~2 500 mg/kg),會對動物生產、發育和繁殖等產生不良影響[2,3],限制了其應用,部分地區甚至將其作肥料,造成飼料資源的嚴重浪費。研究證明,棉粕中游離棉酚含量在0.02%以下時,對動物不具有毒性,我國規定棉籽油中游離棉酚含量不大于0.02%[4]。

 棉粕的脫毒主要可分為物理脫毒法、化學鈍化法、溶劑浸出法和生物脫毒法等。然而傳統的擠壓脫毒法脫毒率低,堿處理之類的化學鈍化法對設備的抗腐蝕要求高,會降低飼料的適口性,溶劑浸出法會造成溶劑殘留等缺點[5-8],因此近幾年棉粕的脫毒方法主要是微生物發酵脫毒[1,4,9]。
     本研究嘗試從適用于飼料原料發酵的酵母屬菌株出發,通過逐級平板馴化法篩選高效降解棉酚的菌株,并利用篩選得到的菌株固態發酵棉粕,通過發酵過程條件優化,得到低棉酚的發酵棉粕,提高棉粕的營養價值和利用率。
    1 材料與方法

1.1 菌種

產朊假絲酵母JD-1、JD-2、JD-3和JD-4,熱帶假絲酵母JD-5、JD-6、JD-7、JD-8和JD-9,啤酒酵母JD-10、JD-11和JD-12,卡氏酵母JD-13,共13株酵母,是實驗室保藏的適用于飼料原料生物技術處理的菌株。

1.2 試劑、原料

正己烷、異丙醇、冰乙酸、苯胺、3-氨基-1-丙醇均為分析純試劑。棉粕購自無錫糧油市場。

1.3 培養基

YPG培養基:酵母膏5 g,蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,加水至1 000 mL,自然pH,固體培養基加入2%的瓊脂。三級篩選培養基平板和馴化培養基分別加入02%、0.4%和0.6%醋酸棉酚后,于121 ℃滅菌20 min。

1.4 菌種篩選

1.4.1 平板篩選 菌種初篩通過多級逐步馴化進行,保藏菌種活化后在含0.2%醋酸棉酚的YPG培養基平板第1次點種,挑選較大菌落至含0.2%醋酸棉酚的YPG液體培養基擴培;在含0.4%醋酸棉酚的YPG培養基平板上第2次點種,挑選較大菌落至含0.4%醋酸棉酚的YPG液體培養基擴培;在含0.6%醋酸棉酚的YPG培養基平板第3次點種,從而篩選出降解棉酚能力強的菌株。

1.4.2 棉粕固態發酵復篩 將平板篩選的酵母菌分別接入YPG斜面培養基,30 ℃培養72 h,挑取1環菌苔分別接入含10 mL YPG液體培養基的試管中,30 ℃培養18 h,再吸取5 mL接入含50 mL YPG液體培養基的250 mL三角瓶中,30 ℃、150 r/min培養20 h,取6 mL菌液接入滅過菌的棉粕中(30 g棉粕,24 mL水),30 ℃發酵60 h,80 ℃烘3 h,粉碎,測定脫毒率。

1.5 棉粕固態發酵工藝優化

1.5.1 單因素試驗 首先研究熱帶假絲酵母JD-9接種量對脫毒率的影響,將經三角瓶培養的熱帶假絲酵母JD-9菌液分別按2%、4%、6%、8%和10%的接種量接入滅過菌的棉粕(30 g棉粕,24 mL水)中,不接種卡氏酵母JD-13,30 ℃發酵60 h。發酵結束后,80 ℃烘干3 h,粉碎,測定脫毒率。

以最優的熱帶假絲酵母JD-9接種量,研究卡氏酵母JD-13接種量對脫毒率的影響,不改變上述其他試驗條件。同理,再分別研究發酵溫度、發酵時間和料水比對脫毒率的影響。

1.5.2 微生物發酵脫毒的響應面分析優化[10,11] 利用SAS軟件中N=8的分式析因試驗設計法對微生物發酵脫毒的參數進行篩選。試驗設計的每個因素取2個水平,對5個因素:熱帶假絲酵母JD-9的接種量、卡氏酵母JD-13的接種量、發酵溫度、發酵時間和料水比進行研究。在確定主因素后,再利用SAS軟件的響應面分析法進行進一步的優化。

1.6 棉酚的測定

采用國標苯胺法[12],本方法適用于棉粕和含有棉粕的配合飼料中游離棉酚的測定。

2 結果與討論

2.1 菌種篩選

2.1.1 醋酸棉酚YPG培養基上的篩選 第1次在0.2%醋酸棉酚YPG平板點種并培養3 d后,除啤酒酵母JD-11和啤酒酵母JD-12沒有生長外,其他菌株生長良好。由于添加了一定濃度的醋酸棉酚,產朊假絲酵母JD-1和產朊假絲酵母JD-3生長緩慢,因此通過第1次平板點種篩選將以上4個菌株淘汰。

第1次挑選出來的菌種經0.2%醋酸棉酚液體培養基馴化擴培后,第2次在0.4%醋酸棉酚平板上點種,由于醋酸棉酚濃度的提高,有些菌株生長速度減慢。除了產朊假絲酵母JD-2、產朊假絲酵母JD-4、熱帶假絲酵母JD-7、啤酒酵母JD-10和卡氏酵母JD-13外,其他菌株生長較好,因此通過第2次點種將以上5個菌株淘汰。

第2次挑選出來的菌株經0.4%醋酸棉酚液體培養基馴化擴培后,第3次在0.6%醋酸棉酚平板上點種。并培養3 d后,熱帶假絲酵母JD-6與熱帶假絲酵母JD-9生長較好,菌落較大,其他兩株生長較慢,菌落較小,初步確定熱帶假絲酵母JD-6和熱帶假絲酵母JD-9為降解棉酚能力較強的菌種。

2.1.2 棉粕固態發酵復篩高效降解棉酚菌株 通過熱帶假絲酵母JD-9發酵脫毒后的棉粕中游離棉酚含量明顯減少,從987.5 mg/kg減少到169.8 mg/kg,脫毒率達到了82.8%。熱帶假絲酵母JD-6發酵脫毒后的棉粕游離棉酚含量也明顯減少,從987.5 mg/kg減少到213.3 mg/kg,脫毒率為78.4%。結果表明熱帶假絲酵母JD-9是一株高效的棉酚降解菌株。

2.2 棉粕固態發酵脫毒工藝參數的優化

2.2.1 熱帶假絲酵母JD-9接種量對脫毒率的影響 接種量是關系到棉粕發酵脫毒效率的一個重要因素。不同的熱帶假絲酵母JD-9接種量對棉粕發酵脫毒率的影響如圖1所示。由圖1可見,隨著接種量的提高,棉粕的脫毒率提高,當接種量達到4%(V/m)時,棉粕的脫毒率達到了82%,而后加大接種量脫毒率的提高幅度很小,因此在后續的研究中采用4%的接種量。



QQ截圖20180524113207.png

2.2.2 卡氏酵母JD-13接種量對脫毒率的影響 棉粕中棉籽糖約占9%,是最主要的含碳物質。熱帶假絲酵母JD-9無法分解利用棉籽糖從而限制其生長。本實驗室獲得的適合用于飼料原料生物技術處理的卡氏酵母JD-13可以分解利用棉籽糖,因此將其按一定量接種,進行混合發酵,不僅可以充分利用棉粕中的不同糖類物質,還有利于熱帶假絲酵母JD-9的生長和降解棉酚,提高脫毒率。

不同的卡氏酵母JD-13接種量對棉粕脫毒率的影響如圖2所示。由圖2可見,當接種量為0.5%時,脫毒率最高,達到90.4 %,再提高接種量反而降低了脫毒率,這可能是由于提高了卡氏酵母JD-13的接種量,使得卡氏酵母的生長占主導,抑制了熱帶假絲酵母JD-9的生長。

2.2.3 發酵溫度對脫毒率的影響 不同發酵溫度對脫毒率的影響如圖3所示。由圖3可見,在25~30 ℃之間,隨著發酵溫度的上升,脫毒率隨之提高,

QQ截圖20180524113328.png

但當發酵溫度超過32 ℃后,發酵脫毒率顯著降低,說明高溫對發酵脫毒有負面影響,而當發酵溫度較低時,微生物的代謝活動降低,從而影響脫毒率。

QQ截圖20180524113449.png

2.2.4 發酵時間對脫毒率的影響 發酵時間對脫毒率的影響如圖4所示。由圖4可見,當發酵時間為48 h時,脫毒效果較好,脫毒率達到90.4 %,再延長發酵時間對提高脫毒率的影響不大,因此采用48 h的發酵時間比之前的60 h更有利于工業生產。

QQ截圖20180524113601.png

2.2.5 料水比對脫毒率的影響 料水比對脫毒率的影響如圖5所示。由圖5可見,當料水比為1∶ 0.8時,底物發酵脫毒率達最大值90.8%,過高的水分含量可能減少了底物的通透性,從而改變熱帶假絲酵母JD-9的性能,降低脫毒率。而底物水分含量過低可能引起棉粕營養物質的溶解性減少,以及底物顆粒的膨脹程度降低,從而影響發酵脫毒效果。
    2.2.6 發酵工藝的優化 為篩選影響棉粕發酵脫

QQ截圖20180524113707.png

毒的主要因素,對熱帶假絲酵母JD-9接種量(X1)、卡氏酵母JD-13接種量(X2)、發酵溫度(X3)、發酵時間(X4)和料水比(X5)5個因素進行了N=8的分式析因設計試驗,結果如表1所示。


表1 影響棉粕發酵脫毒的分式析因設計

試驗號

X1/%

X2/%

X3/℃

X4/ h

X5

脫毒率Y1/%

1

2

0.25

25

60

1∶ 1

71.8

2

6

0.25

25

36

1∶ 0.6

86.8

3

2

0.75

25

36

1∶ 1

88.4

4

6

0.75

25

60

1∶ 0.6

90.0

5

2

0.25

35

60

1∶ 0.6

72.6

6

6

0.25

35

36

1∶ 1

82.8

7

2

0.75

35

36

1∶ 0.6

82.0

8

6

0.75

35

60

1∶ 1

88.0

 表2列出5個因素在分式析因設計下影響棉粕發酵脫毒的主效應分析。方差分析表明,試驗數據具有統計學意義,顯著因子為熱帶假絲酵母JD-9的接種量(P=0.048 2)和卡氏酵母JD-13的接種量(P=0.044 1)。


表2 分式析因設計下的主效應分析

影響因素

SS

MS

F

P﹥F

X1

134.48

134.48

19.266 5

0.048 2*

X2

147.92

147.92

21.192 0

0.044 1*

X3

16.82

16.82

2.409 7

0.260 8

X4

38.72

38.72

5.547 3

0.142 7

X5

0.02

0.02

0.002 9

0.962 2

通過分式析因設計能夠確定出影響棉粕發酵脫毒的主要因素,但不能確定參數的具體值以及各參數之間的交互作用,采用中心組合試驗設計進一步優化影響因素。本試驗設計采用2因素3水平的中心組合試驗設計(CCD),將分式析因設計得到的顯著因素熱帶假絲酵母JD-9接種量和卡氏酵母JD-13接種量重新編碼并進行水平標注。
    表3列出了CCD試驗設計下棉粕發酵脫毒的結果,其中第9~13次試驗為5次重復的中心點試驗,用于考察模型的誤差。


表3 中心組合試驗設計下棉粕發酵的脫毒率

試驗序號

X1/%

X2/%

Y1/%

1

2

0.25

68.6

2

2

0.75

88.6

3

6

0.25

82.4

4

6

0.75

88.4

5

1.2

0.5

72.6

6

6.8

0.5

86.8

7

4

0.24

81.2

8

4

0.76

83.2

9

4

0.5

90.4

10

4

0.5

90.6

11

4

0.5

90.6

12

4

0.5

90.8

13

4

0.5

90.8

對CCD試驗設計結果進行方差分析,經F值檢驗顯示總模型方程高度顯著(P﹤0.001),R2值為0.960 3 ,說明96.03%的脫毒率變異分布在所考察的2個因子中,總變異中僅有3.87%不能由該模型來解釋。通常CV值(變異系數)反映模型的置信度,即CV值越低,模型的置信度越高;本試驗設計的CV值為3.19,說明模型方程能夠很好地反應真實的試驗數據。一次項和二次項的P值都小于0.001,說明模型方程的一次和二次項都高度顯著,因此該試驗設計可以通過二階模型方程進行描述。
  表4列出2個因素在CCD試驗設計下影響棉粕脫毒率的回歸方程系數及其顯著性檢驗。


表4 CCD試驗設計下影響棉粕脫毒率的
回歸方程系數及其顯著性檢驗

 

變量

回歸系數

標準偏差

t

P >︱t︱

常數項

90.63

1.46

61.93

<0.000 1**

X1

4.23

1.16

3.64

0.008 3**

X2

3.64

1.16

3.13

0.016 7**

X21

-5.26

1.26

-4.18

0.004 2**

X1X2

-3.50

1.64

-2.14

0.069 7*

X22

-3.98

1.26

-3.16

0.015 8**

方差分析表明,熱帶假絲酵母JD-9接種量和卡氏酵母JD-13接種量的一次項和二次項都對棉粕的脫毒有顯著影響(P<0.05),而交互項不顯著。因此,棉粕的脫毒率可以通過式(1)進行描述:
     Y1 = 90.63+4.23X1+3.64X2-5.26X21-3.5X1X2-3.98X22

    圖6為根據上述二元二次方程所作的響應面等高線圖及其響應面立體分析圖。利用該圖可看出兩個變量交互影響棉粕脫毒的效應,并對其進行分析與評價,從中確定最佳因素的水平范圍。由圖6可以看出,當熱帶假絲酵母JD-9接種量在0.1~0.4(4.2%~4.8%),卡氏酵母JD-13接種量在02~0.4(0.55%~0.6%)時,棉粕脫毒率較高。

QQ截圖20180524114236.png

對模型方程進行典型性分析表明,模型具有穩定點,穩定點為其最大值。在最優條件下,發酵條件為:熱帶假絲酵母JD-9接種量4.42%,卡氏酵母JD-13接種量0.56%,脫毒率最高為918%。
    為了證明模型預測的準確性,進行3次平行最優條件下的重復性試驗,脫毒率分別為907%、921%、905%,平均值為913% 。說明模型方程真實可行,能夠很好地預測試驗結果。

 

3 結 論

通過醋酸棉酚YPG培養基多級逐步馴化篩選,結合棉粕固態生物發酵的方法,篩選出1株高效降解棉酚的熱帶假絲酵母JD-9。通過單因素試驗初步確定了棉粕發酵脫毒的最佳條件為:發酵時間48 h,發酵溫度30 ℃,熱帶假絲酵母JD-9接種量4%,料水比1∶ 0.8,卡氏酵母JD-13接種量0.5%。

進一步利用分式析因試驗設計法,對影響棉粕脫毒率的因素進行了篩選,方差分析表明,影響棉粕發酵脫毒的主要因素為:熱帶假絲酵母JD-9接種量和卡氏酵母JD-13接種量。通過響應面分析法和典型性分析得出棉粕發酵脫毒的最優條件為:熱帶假絲酵母JD-9接種量4.42%,卡氏酵母JD-13接種量0.56%,發酵時間48 h,發酵溫度30 ℃,料水比1∶ 08,棉粕中的棉酚從9875 mg/kg降解至859 mg/kg,脫毒率達到913%。

參考文獻:

[1]張文舉.高效降解棉酚菌種的選育及棉粕生物發酵的研究[D].杭州:浙江大學,2006.

[2]RANDEL R D, CHASE C C, WYSE S J. Effects of gossypol and cottonseed products on reproduction of mammals [J]. Journal of Animal Science, 1992, 70: 1628-1638.

[3]MORGAN S, STAIR E L, MARTIN T, et al. Clinical clinicopathologic, pathologic and toxicological alterations associated with gossypol toxicosis in feeder lambs [J]. Am Vet Res, 1988, 49: 493.

[4]趙順紅. 棉粕生物發酵脫毒效果[D].新疆 石河子:石河子大學,2007:31-24.

[5]CHERRY J P. Methylene chloride extraction of gossypol from cotton seed products [J]. Food Sci, 1981, 46(6): 1726-1733.

[6]HRON R J. Ethanol vapor deactivation of gossypol in cottonseed meal [J]. J Am Oil Chem Soc, 1996,73(10): 1337-1339.

[7]REISER R, FU H C. The mechanism of gossypol detoxification by ruminant animals [J]. Nutr,1962,76:215-218.

[8]喬國平, 王立, 王興國. 棉籽餅粕脫毒方法研究進展[J]. 糧食與油脂, 2002(3):27-29.

[9]鐘英長, 吳玲娟. 利用微生物將棉籽餅中游離棉酚脫毒的研究[J]. 中山大學學報, 1989, 28(3):67-72.

[10]張寒俊, 劉大川, 李永明. 響應面分析法在菜籽濃縮蛋白制備工藝中的應用[J].中國油脂, 2004, 29(8):41-44.

[11]龔春林. 多學科設計優化技術研究[D]. 西安:西北工業大學,2004.

[12]GB 13086—1991, 飼料中游離棉酚的測定方法[S]. 北京:中國標準出版社,1991.

上一篇:一株高效油脂降解菌的分離鑒定及其性能研究
下一篇:球等鞭金藻海藻油的提取工藝
發表評論
請自覺遵守互聯網相關的政策法規,嚴禁發布色情、暴力、反動的言論。
評價:
用戶名: 驗證碼: 點擊我更換圖片
最新評論 進入詳細評論頁>>
關于我們 聯系方式 法律聲明 投稿須知
性夜影院爽黄e爽