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一株高效油脂降解菌的分離鑒定及其性能研究

發布日期:2018-02-28 17:23來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 劉 婕,楊 博
(華南理工大學 生物科學與工程學院,廣州 510006)


摘要:從餐館隔油池廢水中篩選分離得到一株能高效降解油脂的芽孢桿菌DK-1,經16S rDNA同源性序列分析,鑒定為解淀粉類芽孢桿菌,并進一步考察了菌株的生物量、油脂去除率、CODCr去除率及乳化活性等性能。實驗結果表明,菌體的乳化指數為65%,在初始油脂質量濃度為5 g/L,CODCr為55 000 mg/L左右的模擬高含油有機廢水中,該菌株能生長并快速降解油脂,在48 h內油脂去除率為97.3%,CODCr的去除率為91.9%。 
關鍵詞:篩選;鑒定;解淀粉芽孢桿菌;去除率
中圖分類號:TS22   文獻標志碼:A   文章編號:1003-7969(2010)01-0007-04

Isolation,identification and characteristics of a high effective oil-degrading
LIU Jie,YANG Bo
(School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006, China)


Abstract:An oil-degrading Bacillus stain DK-1 was isolated from oil trap of one restaurant. By 16S rDNA sequence homology analysis, it was identified as Bacillus amyloliquefaciens. The characteristics of the strain such as biomass, oil-degrading ability, CODCr removal ability and activity of emulsification were tested. The results showed that in simulated high-oil organic wastewater where the initial oil mass concentration was 5 g /L,CODCr was about 55 000 mg/L, the strain could grow and quickly degrade oils and fats.The removal rate of oils and fats was 97.3%, and CODCr removal rate was 91.9% in 48 h. 
Key words:screening;identification;Bacillus amyloliquefaciens;removal rate

油脂是生活廢水中引起環境污染的一個重要組成部分,未經處理直接排放的生活污水中的油脂與其他顆粒物質聚集起來可引起下水管道堵塞甚至破裂[1,2]。此外,排入水體的油脂漂浮在河水、湖泊等水面上造成水體溶氧不足,嚴重影響水體的生態環境。

目前用于油脂處理的方法有物理法、化學法和生物法,生物法因其處理效果好、成本低、無二次污染等優點逐步成為油脂廢水處理的首選方法。故從自然界中篩選高效除油微生物并研究其降解工藝已成為目前油脂廢水處理的熱點[3-7]。

芽孢桿菌屬因其可產生芽孢,對環境的耐受性大、抗逆性強、無致病性等優點,逐步成為治理環境污染的首選菌種。本文以芽孢桿菌的篩選鑒定為基礎,初步探討了所篩分到的芽孢桿菌菌株的性能,為菌株的實際應用提供理論指導。

1材料與方法

1.1菌種樣品

取自餐館隔油池廢水。

1.2培養基

1.2.1LB培養基

蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl5g/L,培養基pH7.2,121℃滅菌20min。

1.2.2富集培養基

K2HPO43g/L,NaCl5g/L,MgSO4·7H2O1g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,大豆油質量濃度為10g/L,培養基pH7.2,121℃滅菌20min。

1.2.3馴化培養基

(NH4)2SO40.5g/L,K2HPO40.3g/L,NaCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,大豆油質量濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5g/L,培養基pH7.2,121℃滅菌20min。

1.2.4選擇性平板培養基

(NH4)2SO40.5g/L,K2HPO40.3g/L,NaCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L;大豆油質量濃度10g/L,pH7.2,瓊脂20g/L。將上述溶液加入少許乳化劑于微波爐中加熱至瓊脂完全溶解后用均質機將油脂分散成很均勻的體系,待冷卻至60℃左右時于超凈臺中倒入無菌平板中,冷卻后用紫外燈照射滅菌30min以上備用。

1.2.5高含油有機廢水培養基

K2HPO40.3g/L,NaCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏2.5g/L;大豆油質量濃度為5g/L;pH7.2,121℃滅菌20min。

1.3菌種的分離純化

量取一定量餐館隔油池廢水于80℃下放置15min之后接入富集培養基中,待培養液中油脂降解完之后再重新接入新鮮的富集培養基中,如此重復3次后再將其接入大豆油質量濃度依次升高的無機鹽培養基中進行馴化。于37℃,200r/min,馴化5個周期,每周期5d。

馴化結束后,取一定量涂布于以大豆油為唯一碳源的選擇培養基平板上。待菌落長出后,挑取生長旺盛單菌落點接入選擇培養基平板上。培養48h后挑取透明圈稍大的菌落進行多次重復劃線分離,直到得到純菌種。純化后的菌株貯存于4℃冰箱中備用。

1.4菌株16SrDNA鑒定

采用酚-氯仿-異戊醇法提取細菌DNA為PCR擴增的模板,應用Oligo5.0設計引物對,分別命名為P16sF1和P16sR1,該引物對可擴增出全長的16SrDNA序列,預期擴增片段大小為1.5~1.6kb:

P16sF1:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT;

P16sB1:TACGGCTACCTTGTTACGACTCACCCC。

PCR程序為:94℃預變性5min;循環體采用94℃變性30s;50℃退火30s,72℃延伸1min30s,共30個循環;最后一次延伸10min,于4℃保存。PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳驗證后直接進行測序,測序結果應用Blast軟件與Genebank上序列進行同源性的比較。

1.5菌體乳化活性的測定

用接種環從菌種斜面上挑取一定的菌體接種于LB培養基中,在37℃、200r/min搖床中振蕩培養24h后于6000r/min冷凍離心10min后收集上清備用。然后在帶刻度的磨口試管中,加入4mL大豆油和6mL上清,渦旋振蕩器充分振蕩2min,室溫靜置24h后測量乳化層高度,以乳化指數(Emulsificationindex)表示乳化物質的乳化活性,如乳化指數大于50%,則表示該乳化液穩定[8]。

乳化指數=乳化層高度/有機相總高度×100%

1.6模擬高含油廢水中菌株性能的測定

用接種環從菌種斜面中接入少量菌體于LB培養基中培養10~12h后接種于1.2.5所述培養基中,該培養基初始大豆油質量濃度為5g/L,初始CODCr約為55000mg/L,每隔8h取樣檢測培養液中的菌體生物量,殘油含量和CODCr的降解情況。

1.6.1菌體生物量的測定

菌體生物量的測定采用UV7200型分光光度計于600nm處測得的吸光度OD菌體表示,通過菌液所產生的OD菌液值減去油脂乳化產生的上清的OD上清值計算而得,即OD菌體=OD菌液-OD上清。

1.6.2殘油含量的測定

殘油含量的測定采用紫外分光光度法[9]

1.6.3CODCr值的測定

CODCr的測定參照國家標準GB11914-1989的重鉻酸鉀法。

2結果與討論

2.1菌種分離純化

從餐館隔油池廢水中經富集、馴化、分離、純化后分離到一株油脂降解菌命名為DK-1。

2.2菌株16SrDNA鑒定結果

以所提取的基因組DNA為模板經PCR擴增后其產物的電泳圖如圖1。圖1表明,PCR結束后經過瓊脂糖凝膠電泳檢測出了預期條帶。擴增產物直接測序,所得結果運用Blast軟件進行分析表明,結果,該序列與解淀粉類芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的同源性為97%,故確定為解淀粉類芽孢桿菌。


2.3菌株的乳化活性

油脂因其比重小、疏水等性質,使得其大部分均聚集、漂浮于水體表面,形成油層或油滴,限制微生物對其的利用。DK-1能產生具有良好乳化作用的生物表面活性劑,能將油脂乳化使其均勻分散于水體中,故能加大其對油脂的接觸面積,更好的降解油脂。經測定DK-1乳化指數為65%,表明DK-1產生的生物活性物質有較好的乳化效果,使該菌株能更好的利用、降解油脂。

2.4菌體生物量的變化

菌體在培養體系中生物量的變化如圖2。圖2表明菌體接種后適應性好,繁殖能力強,菌體生物量在前40h呈現持續上升的趨勢,無明顯的延滯期,在40h時其OD菌體值達18.36,在40h后菌體生物量達到穩定狀態,菌體生物量不再增加。


2.5油脂去除率隨時間的變化

微生物對油脂的去除主要依靠自身分泌出的脂肪酶水解乳化體系中的油脂分子成為可被吸收利用的小分子,進而被進一步降解來完成的。圖3表明,隨著時間的延長,菌株的油脂去除率相應增加,在前8h對油脂的去除速率較慢,在8~16h時迅速增大,在48h時其去除率達97.3%。

2.6CODCr隨時間的變化

油脂、蛋白質等大分子物質是引起水體中CODCr增加的主要成分。圖4表明,DK-1對高含油廢水中的CODCr去除有明顯效果。在48h時,經離心后上清液的CODCr降為4492mg/L,對CODCr去除率達91.9%。


3結論

從餐館隔油池廢水中分離到一株高效油脂降解

 

菌DK-1,經16SrDNA鑒定確定為解淀粉類芽孢桿菌。經實驗表明,當油脂質量濃度為5g/L時,菌體能迅速生長繁殖,到40h時其菌體的OD菌體值達18.36,培養48h后其油脂去除率為97.3%,CODCr的去除率為91.9%。且該菌能產生具有良好乳化效果的生物表面活性劑,使得培養液能迅速被乳化成白色均勻的體系,其乳化指數為65%,表明該物質能產生穩定的乳化效果。但其產生的表面活性劑的成分尚未確定,還需進一步的研究。由于該菌自身能乳化油脂,因此在除油過程中無需額外投加乳化劑或表面活性劑,在一定程度上降低了油脂廢水的處理成本,故該菌對于油脂廢水的處理具有較好的應用前景,如將其與其他無乳化活性的降油菌聯合使用的話可進一步縮短處理時間,提高油脂廢水處理效率。

參考文獻:
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[9] 沈叔平,汪小梅.廢水中動植物油脂的紫外分光光度測定法[J]. 中國環境監測,1994,10(3):4-7.
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