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麥稈堿預處理和同步糖化發酵工藝優化研究

發布日期:2017-10-24 17:29來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 崔茂金,李長恭,祝勇,鄧月娥
 
(河南科技學院化學化工學院,河南新鄉453003)
 
摘要:通過響應面法和正交實驗分別優化了麥稈的堿預處理工藝條件和同步糖化發酵工藝條件。首先以麥稈為底物通過Box-behnken設計研究了預處理溫度、NaOH質量分數、預處理時間和底物質量濃度對總還原糖含量的影響;然后通過正交實驗對堿預處理麥稈的同步糖化發酵工藝進行優化。結果表明:最佳堿預處理工藝條件為預處理溫度137.64℃、NaOH質量分數6.72%、預處理時間41.93min和底物質量濃度9.23g/L,此時總還原糖含量最高,為496.00mg/g,為未預處理底物的5.12倍,說明堿預處理可以較好地提高麥稈的糖化率;最佳同步糖化發酵工藝條件為發酵溫度39℃、酵母接種量0.1%、酶質量濃度0.2g/L和發酵時間2d,此時乙醇含量最高,為22.84g/L。
 
關鍵詞:麥稈;堿預處理;同步糖化發酵;乙醇;優化
 
中圖分類號:X712;S216.2文獻標識碼:A
 
文章編號:1003-7969(2017)08-0098-05

Optimization of alkali pretreatment and simultaneous saccharification and
fermentation process of wheat straw
CUI Maojin, LI Changgong, ZHU Yong, DENG Yue’e
(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Henan Institute of Science and Technology,
Xinxiang 453003, Henan, China)
 
 
Abstract:Response surface methodology and orthogonal experiment were used to optimize alkali pretreatment conditions and simultaneous saccharification and fermentation conditions of wheat straw. Firstly, the effects of pretreatment temperature, NaOH mass fraction, pretreatment time and substrate mass concentration on the content of total reducing sugar were studied by Box-behnken design using wheat straw as substrate. Then simultaneous saccharification and fermentation conditions of wheat straw pretreated by alkali were optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimal alkali pretreatment conditions of wheat straw were obtained as follows: pretreatment temperature 137.64 ℃, NaOH mass fraction 6.72%, pretreatment time 41.93 min and substrate mass concentration 9.23 g/L. The maximum content of total reducing sugar was 496.00 mg/g under the optimal alkali pretreatment conditions, which was 5.12 times of that from raw materials, indicating that alkali pretreatment was necessary to improve the saccharification efficiency of wheat straw. The optimal simultaneous saccharification and fermentation conditions of wheat straw pretreated by alkali were obtained as follows: fermentation temperature 39 ℃, yeast inoculation 0.1%, enzyme mass concentration 0.2 g/L and fermentation time 2 d. The maximum of ethanol content was 22.84 g/L under the optimal simultaneous saccharification and fermentation conditions.
Key words:wheat straw; alkali pretreatment; simultaneous saccharification and fermentation; ethanol; optimization

我國《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006—2020年)》中指出,農林生物質綜合開發利用是今后國家重點發展領域——農業中優先發展的主題。木質纖維素生物質如農作物秸稈、樹葉、草等資源豐富,廉價可再生。但是大量的木質纖維素生物質被丟棄或者焚燒,沒有得到充分的利用,這不僅浪費了能源,而且污染了環境。如果將木質纖維素生物質轉化為清潔能源如乙醇、生物柴油、氫氣,不僅可以緩解能源危機,而且可以減少環境污染,可以取得一舉兩得效果[1]。
 
木質纖維素生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素3部分構成。半纖維素結合在纖維素和木質素中,木質素包圍著纖維素和半纖維素,這種結構使其自身具有難溶性和高結晶度,從而使得木質纖維素生物質很難直接被酶解和發酵。所以木質纖維素生物質在轉化為能源前,必須要對其進行預處理。預處理后木質纖維素結構變得疏松,增大了酶與纖維素的接觸面積,從而有效地提高酶解效率[2-4]。常見的木質纖維素預處理方法有物理方法、化學方法、物理化學方法和生物方法[5-9]。木質纖維素發酵制乙醇工藝主要有分步糖化發酵、同步糖化發酵、半同步糖化發酵和同步糖化共發酵4種方式[10]。同步糖化發酵是一種常用有效的木質纖維素生物質轉化為乙醇的方法,它將預處理后的木質纖維素生物質的酶解和發酵在同一容器中同時進行,酶解產生的糖立即被用來發酵產乙醇。同步糖化發酵可以避免酶解產糖的增加對酶活性的抑制,從而提高了酶解效率和乙醇產率,而且縮短了酶解時間和發酵時間,從而降低了酶解、發酵成本[11-15]。
 
基于此,本研究以稀堿預處理的麥稈為底物進行同步糖化發酵。首先利用Box-behnken設計對麥稈的堿預處理工藝進行優化,然后以最佳堿預處理條件下的麥稈為底物,用正交實驗對底物的同步糖化發酵工藝進行優化。利用X-射線衍射和紅外光譜對原料、堿預處理的底物和發酵后的底物進行表征。
 
1材料與方法
 
1.1實驗材料
 
麥稈于2015年5月取自新鄉市郊區,自然晾干,機械粉碎后在105℃下烘干至恒重,備用。麥稈中灰分含量為8.89%。安琪耐高溫釀酒高活性干酵母,購于安琪酵母股份有限公司;纖維素酶,購于西安沃爾森生物技術有限公司;其他試劑均為分析純。
 
JY-6A恒溫攪拌油浴鍋,SHA-C水浴恒溫振蕩器,FA1004電子天平,WFJ7200可見光分光光度計,DF-101S數顯集熱式磁力攪拌器,FTRI-7600紅外光譜儀,DX-2700BX-射線衍射儀。
 
1.2實驗方法
 
1.2.1麥稈堿預處理
 
分別稱取不同質量麥稈粉于圓底燒瓶中,然后分別加入20mL不同質量分數的NaOH溶液,將圓底燒瓶在恒溫攪拌油浴鍋中不同溫度下加熱不同時間,冷卻后測定總還原糖含量。離心,取沉淀水洗至中性,105℃干燥3h,備用。每組實驗重復3次,取平均值??傔€原糖含量的測定采用苯酚-濃硫酸法[16]。
 
1.2.2同步糖化發酵
 
準確稱取1g干燥的堿預處理麥稈于100mL三角瓶中,然后分別加入45mLpH為4.8的0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液配制的纖維素酶液,然后加入5mL用葡萄糖活化的酵母,在不同溫度下發酵不同時間,發酵結束后測定乙醇含量。每組實驗重復3次取平均值。乙醇含量的測定采用重鉻酸鉀法[17]。
 
1.2.3樣品的表征
 
1.2.3.1結晶度分析
 
原料、預處理樣品和發酵樣品的結晶度可通過X-射線衍射儀進行測定。測定時掃描步長0.02(°)/s,掃描范圍5°~60°。
 
在前期實驗的基礎上,根據Segal公式計算樣品的相對結晶度[18]:
 
 
式中:CrI表示相對結晶度,I002為002面衍射峰的極大強度(2θ=22.5°),Iam為衍射角18°時非結晶背景的散射強度。
 
1.2.3.2紅外分析
 
原料、預處理樣品和發酵樣品的FT-IR譜圖在紅外光譜儀上測定,波數掃描范圍為4000~400cm-1,掃描32次。
 
2結果與討論
 
2.1麥稈堿預處理的響應面優化實驗
 
在前期實驗基礎上,根據Box-behnken中心組合實驗設計原理,以預處理溫度(X1)、NaOH質量分數(X2)、預處理時間(X3)和底物質量濃度(X4)為因素,總還原糖含量(Y)為指標,設計了四因素三水平的響應面實驗。響應面實驗因素與水平見表1,響應面實驗設計及結果見表2。
 
 
 
 
應用Design-expert軟件處理表2數據,經回歸擬合得到麥稈堿預處理工藝條件的回歸方程:
 
Y=481.68+18.02X1+51.62X2+39.71X3-16.07X4-4.50X1X2+9.96X1X3-2.80X1X4-31.59X2X3-20.49X2X4+38.68X3X4-22.64X21-122.86X22-69.78X23-55.64X24
 
對回歸方程進行回歸分析,結果見表3。從表3可以看出,模型的P<0.01,回歸方程差異極顯著,說明實驗設計方案準確可行,可以用該方程模擬麥稈堿預處理的四因素三水平分析。一次項X2和X3影響極顯著(P<0.01);二次項X22、X23和X24影響極顯著(P<0.01)。CV(離散系數)表示實驗的精確度,CV值越大,實驗結果的可靠性越低,本實驗的CV值為11.32%,在可接受的范圍內,說明實驗結果可靠,可以用此模型對堿預處理麥稈產還原糖進行分析和預測。
 
 
 
對回歸方程求一階偏導數得:X1=0.441,X2=0.179,X3=0.247,X4=-0.103。得到麥稈的最佳堿預處理工藝條件為預處理溫度137.64℃、NaOH質量分數6.72%、預處理時間41.93min和底物質量濃度9.23g/L,此時總還原糖含量為496.00mg/g,為未預處理底物的5.12倍(未處理的麥稈中總還原糖含量為96.91mg/g),說明堿預處理可以較好地提高麥稈的糖化率。
 
2.2同步糖化發酵正交優化實驗
 
以最佳條件下堿預處理的麥稈為底物,利用正交實驗優化同步糖化發酵條件。在前期實驗的基礎上,選取發酵溫度(A)、酵母接種量(B)、酶質量濃度(C)和發酵時間(D)4個條件為因素,乙醇含量為指標,設計了四因素三水平正交實驗,正交實驗因素水平見表4。
 
 
 
 
 
正交實驗設計及結果見表5。從表5可以看出,4個因素對堿預處理的麥稈同步糖化發酵影響的主次順序為發酵溫度(A)>酵母接種量(B)>酶質量濃度(C)>發酵時間(D)。最佳組合為A3B1C1D1,即發酵溫度為39℃、酵母接種量為0.1%、酶質量濃度為0.2g/L和發酵時間為2d。在最佳條件下做驗證實驗,乙醇含量為22.84g/L。
 
 
 
正交實驗方差分析見表6。從表6可以看出,各因素對堿預處理的麥稈同步糖化發酵影響的主次順序為發酵溫度(A)>酵母接種量(B)>酶質量濃度(C)>發酵時間(D),這與極差分析結果是一致的。發酵溫度對堿預處理的麥稈同步糖化發酵影響極顯著,酵母接種量和酶質量濃度影響顯著,而發酵時間影響不顯著。
 
 
 
 
2.3麥稈原料、預處理樣品和發酵樣品的表征
 
2.3.1結晶度分析
 
生物質的結晶度是影響其酶解和發酵效率的重要因素。許多研究表明由于預處理能降解部分半纖維素和木質素,從而改變了纖維素的結晶度。為了研究麥稈原料、堿預處理樣品和發酵樣品結晶度的變化,對上述3個樣品進行了X-射線衍射分析,并根據Segal公式計算結晶度。3個樣品的XRD譜圖如圖1所示。
 
從圖1可以看出,麥稈經堿預處理和發酵后,其在2θ=16°和2θ=22.5°的衍射峰強度明顯增加,尤其是代表結晶區強度的002面衍射峰(2θ=22.5°)強度增加得更為明顯。這是因為預處理使得麥稈中的半纖維素和木質素被去除,從而使得纖維素相對含量增加。通過Segal公式計算可知麥稈原料的相對結晶度為66.07%,堿預處理樣品的相對結晶度為47.36%,發酵樣品的相對結晶度為40.29%。這是因為堿預處理過程中,由于半纖維素和木質素被去除,使得預處理樣品中結晶態纖維素結構變得松散,導致其相對結晶度降低。糖化發酵樣品的結晶度降低是因為半纖維素和木質素的去除使得更多的纖維素暴露在表面,提高了酶的可及度,進而提高了酶解發酵效率。
 
 
 
 
2.3.2紅外分析
 
對麥稈原料、堿預處理樣品及發酵樣品進行紅外分析,結果如圖2所示。
 
 
 
從圖2可以看出,3446cm-1是—OH的伸縮振動吸收峰;2918cm-1是甲基、亞甲基和次甲基的C—H伸縮振動峰,1646cm-1是木質素的CO伸縮峰[19]。3446cm-1和2918cm-1兩個吸收峰的吸收強度在堿預處理和發酵后增強了,這是由于在堿預處理過程中去除了原料中的粗蛋白質、粗脂肪、半纖維素和部分木質素,從而使得纖維素的含量增加。堿預處理樣品和發酵樣品的這兩個吸收峰的吸收強度差不多,這是由于堿預處理過程中半纖維素部分降解了,但是纖維素的含量增加了,而在發酵過程中纖維素部分降解但是半纖維素的含量增加了,兩者相互抵消從而導致紅外譜圖的吸收峰變化不大。預處理樣品和發酵樣品中,1646cm-1的吸收峰的吸收強度與原料相比有所增強,但預處理樣品和發酵樣品相比吸收強度差不多,說明這兩種樣品中更多的木質素暴露出來從而導致吸收峰強度增加,而在糖化發酵過程中木質素不能被酶解發酵從而使得木質素的含量變化不大。
 
3結論
 
本文利用響應面法和正交實驗分別優化了麥稈的堿預處理工藝和同步糖化發酵工藝,得出如下結論:
 
(1)最佳堿預處理工藝條件為預處理溫度137.64℃、NaOH質量分數6.72%、預處理時間41.93min和底物質量濃度9.23g/L,此時總還原糖含量最高,為496.00mg/g,為未預處理底物的5.12倍,說明堿預處理可以較好地提高麥稈的糖化率。
 
(2)最佳同步糖化發酵工藝條件為發酵溫度39℃、酵母接種量0.1%、酶質量濃度0.2g/L和發酵時間2d,此時乙醇含量最高,為22.84g/L,說明堿預處理可以有效地提高麥稈轉化為乙醇的效率。
 
(3)XRD譜圖表明堿預處理樣品和發酵樣品中纖維素的結晶度降低,FT-IR譜圖表明堿預處理樣品和發酵樣品在3446、2918、1646cm-1處的特征吸收峰強度都增大了。

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