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溫度對裂殖壺菌S31中FAS及PKS基因轉錄水平的影響

發布日期:2017-10-24 16:59來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 婁菲,張濤,劉睿杰,常明,金青哲,王興國
 
(江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,食品營養與安全協同創新中心,江蘇無錫214122)
 
摘要:以甘油為碳源,測定了搖瓶中裂殖壺菌S31進入脂質積累期后,溫度對胞內油脂脂肪酸組成以及FAS和PKS基因轉錄水平的影響。結果表明:當裂殖壺菌進入脂質積累階段后,提高發酵溫度到30℃會減少藻油中DHA的含量,FAS基因的轉錄水平比PKS基因的更高;同時,降低發酵溫度到20℃會提高裂殖壺菌S31藻油DHA的含量,PKS基因的轉錄水平顯著高于FAS基因的。實驗結果表明,溫度對PKS和FAS基因的轉錄水平有顯著的影響,從而決定裂殖壺菌S31中藻油脂肪酸組成的變化。
 
關鍵詞:裂殖壺菌;DHA;FAS;PKS;轉錄調控
 
中圖分類號:Q936;Q812文獻標識碼:A
 
文章編號:1003-7969(2017)08-0089-04

Influence of temperature on FAS and PKS genes transcription 
levels of Schizochytrium sp.S31
LOU Fei, ZHANG Tao, LIU Ruijie, CHANG Ming, JIN Qingzhe, WANG Xingguo
(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, State Key Laboratory of Food Science and
Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)
 
 
Abstract:Using glycerol as carbon source, the effects of temperature on the cellular oil fatty acid composition, FAS and PKS genes transcription levels were measured after Schizochytrium sp. S31 entering lipid accumulation stage in shake flask. The results showed that after the cells entering lipid accumulation stage, when the fermentation temperature increased to 30 ℃, the DHA content in algal oil decreased, and the FAS gene transcriptional level was higher than that of PKS. When the fermentation temperature decreased to 20 ℃, the DHA content in algal oil increased and the PKS gene transcriptional level was significantly higher than that of FAS. All these datas showed that temperature had significant effects on PKS and FAS genes transcriptional levels, which determined the changes of fatty acid composition in algal oil of Schizochytrium sp. S31. 
Key words:Schizochytrium; DHA; FAS; PKS; transcriptional regulation

DHA(C22∶6)是一種重要的n-3系列多不飽和脂肪酸,被許多醫學研究認定為必需營養成分[1-4]。很多破囊弧菌菌株可以積累大量的甘油三酯(50%~80%干菌質量),且其中多不飽和脂肪酸的比例尤其是DHA和DPA(C22∶5,n-6)非常高[5]。目前普遍認為破囊弧菌中存在兩條多不飽和脂肪酸(PUFAs)的合成途徑,其一是“標準”途徑,在此途徑中PUFAs是由C14∶0經一系列的延長酶和去飽和酶作用合成的[6]。這個過程需要氧分子的參與,因此又叫需氧DHA生物合成途徑[7]。另一途徑為PKS途徑,它不需要氧分子的參與把雙鍵加到已有的?;溕?,而是在脂肪酸合成的過程中直接引進的,因此又稱為“厭氧”PKS途徑[8]。
 
裂殖壺菌S31屬于破囊弧菌的一種,可以產生超過40%的DHA和DPA[9]。有研究表明在裂殖壺菌S31體內厭氧PKS途徑才是合成DHA和DPA的唯一途徑[10]。作為PKS途徑的補充,FAS途徑則是負責其他飽和脂肪酸的合成。并且這兩條途徑存在競爭關系,因為兩者有重合的反應,并且會競爭相同的底物如丙二酰輔酶A或者NADPH來合成相應的脂肪酸[11]。
 
溫度作為發酵過程中的一個重要影響因素,已經被廣泛應用以提高DHA含量[12]。低溫會使藻油中多不飽和脂肪酸的含量增加,但低溫同時會抑制細胞生長,降低發酵產量。因此,有人已經嘗試兩階段溫度控制發酵實驗。當采用裂殖壺菌HX-308在30℃條件下發酵32h然后轉到20℃條件下發酵12h,DHA的含量可以達到51.98%[13]。然而,對于其準確調控機制卻知之甚少,這也阻礙了進一步利用該機制繼續擴大藻油中DHA含量的相關研究。轉錄分析是了解基因表達調控機制的基礎,能夠為環境響應機制以及細胞應答機制提供更為深入的見解。因此,本文通過在不同發酵溫度條件下對裂殖壺菌S31中FAS及PKS脂肪合成酶系的基因轉錄水平進行系統研究,闡明其調控脂肪酸合成的分子機制。
 
1材料與方法
 
1.1實驗材料
 
裂殖壺菌S31,由美國標準菌庫(ATCC)獲得,并保存在ATCC790By+培養基中(人工海水中包含:5g/L葡萄糖,1.0g/L酵母提取物及1.0g/L胨)。
 
種子培養基:葡萄糖,30g/L;氯化鈉,0.3g/L;酵母膏,5g/L;硫酸鈉,15g/L;硫酸鉀,1g/L;谷氨酸鈉,5g/L;磷酸氫二鉀,2g/L;七水硫酸鎂,3g/L;磷酸二氫鉀,3g/L;氯化鈣,0.02g/L;維生素B1,0.005g/L;維生素B6,0.002g/L;維生素B12,0.005g/L。
 
發酵培養基:甘油,100g/L;酵母提取物,10g/L;NaCl,0.3g/L;硫酸鈉,15g/L;谷氨酸鈉,15g/L;硫酸鉀,1g/L;七水硫酸鎂,4g/L;磷酸二氫鉀,0.1g/L;氯化鈣,0.05g/L;維生素B1,0.008g/L;維生素B6,0.002g/L;維生素B12,0.008g/L。1.2實驗方法
 
1.2.1搖瓶發酵培養
 
由于不同初始細胞數會嚴重影響之后的油脂合成及DHA含量[14],兩組搖瓶均控制在25℃以使其達到相同的細胞數。當氮源耗盡進入油脂合成階段時,將其中一組的發酵溫度上調為30℃,另一組下調為20℃。當殘余碳源含量低于15g/L時,發酵停止。
 
細胞干重、總脂含量、脂肪酸組成、甘油質量濃度及氨基氮質量濃度的測定方法參考文獻[15]。以上指標均重復測定3次,取平均值加標準偏差。
 
1.2.2RNA提取及反轉錄
 
取5g發酵液在4℃條件下6000r/min離心10min。棄上清,迅速將下層細胞浸入液氮速凍1min,然后轉移到-80℃冰箱??俁NA采用SV總RNA提取試劑盒(Promega,USA)按說明書操作。殘余的基因組DNA污染采用10單位的DNAseI(Takara,China)在37℃下30min,然后在80℃下5min使DNAse失活的方法去除。用目標基因及參照基因引物,采用RNA-PCR的方法證明RNA樣品不存在基因組DNA污染。RNA的反轉錄采用Tiangen反轉錄試劑盒按照說明書條件操作(Tiangen,China)。
 
1.2.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)
 
目標基因及參照基因的mRNA水平通過RT-qPCR方法,采用SYBRGreen染料法測定。RT-qPCR采用CFX-96TM系統(Bio-Rad,USA)的96孔板。
 
基因的相對表達水平采用ΔΔCT法。計算方法如下:基因的表達水平是與參照基因β-actin作比較的,ΔCT=CT(目標基因)-CT(β-actin)。對照組(25℃)的基因表達水平與調控組(30℃或20℃)作比較,ΔΔCT=ΔCT(調控組)-ΔCT(對照組)。相對表達水平表示為2-ΔΔCT。每個樣品測定3次,取其平均值加標準偏差。
 
1.2.4引物列表
 
PKS的3個亞基分別由3個基因編碼而成,FAS是單一蛋白。引物序列如表1所示。
 
 
2結果與討論
 
2.1溫度調節后搖瓶內的菌體生長、脂質積累及脂肪酸組成
 
初始發酵溫度控制在25℃條件下發酵72h氮源耗盡,標志著菌體進入脂質積累階段。然后將其中一組溫度上調為30℃,另一組下調為20℃。當溫度上調為30℃時,甘油及氨基氮的消耗速度均呈現增長趨勢,如圖1所示。
 
 
由圖1可知,當甘油質量濃度降低為13.2g/L時,發酵停止,細胞干重達到20.6g/L且總脂含量為40.99%。而對于溫度下調組,溫度下調后甘油及氨基氮的消耗速度均減慢,如圖2所示。
 
 
由圖2可知,當甘油質量濃度為12.4g/L時發酵停止,細胞干重達到25.5g/L且總脂含量達到47.72%。
 
調節溫度后,細胞脂肪酸組成及含量也表現出相應的變化,見表2、表3。通常將PFAS定義為除DHA和DPA之外的其他脂肪酸。在本研究中,將PPKS定義為DHA和DPA之和。由表2可知,當采用30℃的發酵溫度下,隨著發酵時間的延長,PFAS升高而PPKS降低。由表3可知,在20℃的發酵溫度下,隨著發酵時間延長,PFAS下降而PPKS不斷上升。
 
 
 
 
2.2搖瓶發酵溫度調節后FAS及PKS基因的轉錄水平變化
 
目標基因的mRNA水平的變化是由RT-qPCR測定的。發酵72h進入脂質積累階段后調節溫度,各基因的表達情況如圖3、圖4所示。
 
由圖3可知,對于溫度上調組(30℃),發酵時間為72.5h時,FAS基因的轉錄水平降低為原來的32%,而PFA2和PFA3分別降低為原來的29%及32%;而在發酵時間為75h時,FAS擴大為原來的3倍,而PFA1只有原來的80%。因此,在溫度上調的過程中,FAS基因相比PKS基因更有優勢。
 
 
 
由圖4可知,對于溫度下調組(20℃),發酵時間為73.5h時,PFA1、PFA2及PFA3的表達水平均增長為原來的2倍,而FAS基因的表達水平卻沒有表現出明顯的變化;在發酵時間為75h時,PFA1和PFA3分別迅速增長為原來的9倍及10倍,而FAS基因增長為原來的3倍;在發酵時間超過75h后,所有目標基因的表達水平均有所下降,但PKS基因相對FAS基因仍具有明顯優勢。
 
在此過程中,PFA1、PFA2及PFA3表現出了不同的變化趨勢,這或許可以解釋為3個亞基在脂肪酸合成過程中起著不同的作用??梢钥隙ǖ氖?,3個亞基對于維持PKS基因的完整功能是不可或缺的。
 
3結論
 
通常來說,較低的發酵溫度不利于菌體的生長,卻會提高油脂中不飽和脂肪酸的含量,因此兩階段溫度控制策略被廣泛用來提高藻油中DHA的含量。本研究解釋了改變發酵溫度條件如何影響DHA含量,即其分子生物學調控機制。當發酵溫度升高時,FAS基因比PKS基因更具優勢;而當發酵溫度降低時,PKS基因相比FAS基因更具優勢。同時,脂肪酸組成的變化情況也與之相吻合。因此推測,裂殖壺菌S31通過調整脂肪酸組成來適應外部環境如溫度的變化,而這一生物學過程至少部分是由FAS基因和PKS基因共同轉錄調控的。
 
除了溫度之外,還有很多其他因素例如碳源、溶氧及金屬離子等影響著DHA的生物合成,并且與FAS基因和PKS基因的表達水平有關。因此,后期可以進行更多這些因素與基因表達情況之間關系的研究。同時了解分子層面的調控機制之后,可以嘗試采用基因工程手段使PKS基因過表達同時抑制FAS基因的表達或通過一定的手段使其不表達來進一步提高油脂中DHA的基因。

參考文獻:
[1] 曹萬新, 孟橘, 田玉霞. DHA 的生理功能及應用研究進展[J]. 中國油脂, 2011, 36(3): 1-4.
[2] CRAWFORD M A, CRAWFORD M A, COSTELOE K, et al. Are deficits of arachidonic and docosahexaenoic acids responsible for the neural and vascular complications of preterm babies?[J]. Am J Clin Nutr, 1997, 66(4): 1032S-1041S.
[3] HORROCKS L A, YEO Y K. Health benefits of docosahexaenoic acid (DHA)[J]. Pharmacol Res, 1999, 40(3): 211-225. 
[4] UAUY R, HOFFMAN D R, PEIRANO P, et al. Essential fatty acids in visual and brain development[J]. Lipids, 2001, 36(9): 885-895. 
[5] 孫冠男, 任路靜, 瞿亮, 等. 裂殖壺菌單細胞油脂的組分特性分析[J]. 中國油脂, 2013, 38(6): 70-73.
[6] KANG D H, ANBU P, KIM W H, et al. Coexpression of Elo-like enzyme and Δ5, Δ4-desaturases derived from Thraustochytrium aureum ATCC 34304 and the production of DHA and DPA in Pichia pastoris[J]. Biotechnol Bioproc E, 2008, 13(4): 483-490.
[7] QIU X. Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22∶ 6-4, 7, 10, 13, 16, 19): two distinct pathways[J]. Prostag Leukotr ESS, 2003, 68(2): 181-186.
[8] METZ J G, ROESSLER P, FACCIOTTI D, et al. Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes[J]. Science, 2001, 293(5528): 290-293.
[9] RATLEDGE C. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production[J]. Biochimie, 2004, 86(11): 807-815. 
[10] LIPPMEIER J C, CRAWFORD K S, OWEN C B, et al. Characterization of both polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathways in Schizochytrium sp.[J]. Lipids, 2009, 44(7): 621-630. 
[11] HAUVERMALE A, KUNER J, ROSENZWEIG B, et al. Fatty acid production in Schizochytrium sp.: involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase[J]. Lipids, 2006, 41(8): 739-747. 
[12] 王澍, 呂小義, 張靜雯, 等. 不同碳氮源濃度和培養溫度對裂殖壺菌產 DHA 的影響[J]. 中國油脂, 2015, 40(10): 74-77.
[13] ZENG Y, JI X J, LIAN M, et al. Development of a temperature shift strategy for efficient docosahexaenoic acid production by a marine fungoid protist, Schizochytrium sp. HX-308[J]. Appl Biochem Biotech, 2011, 164(3): 249-55.
[14] CHI Z, LIU Y, FREAR C, et al. Study of a two-stage growth of DHA-producing marine algae Schizochytrium limacinum SR21 with shifting dissolved oxygen level[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 81(6): 1141-1148.
[15] CHANG G, GAO N, TIAN G, et al. Improvement of docosahexaenoic acid production on glycerol by Schizochytrium sp. S31 with constantly high oxygen transfer coefficient[J]. Bioresour Technol, 2013, 142: 400-406.
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