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磷酸香草醛法測定不同培養條件下四尾柵藻總脂含量

發布日期:2017-10-23 11:45來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 張曼1,郜小龍1,張麗2,祝偉霞2
 
(1.河南師范大學水產學院,河南新鄉453007;2.河南出入境檢驗檢疫局,鄭州450003)
 
摘要:驗證了磷酸香草醛反應在不同氮(0.2、2、20、40mg/L)、磷(0.1、1、10、20mg/L)質量濃度培養條件下測定四尾柵藻總脂含量的可靠性。結果表明:不同氮、磷質量濃度條件下柵藻總脂含量和磷酸香草醛測定吸光度之間均呈顯著的線性回歸關系(不同氮質量濃度條件:R=0.997,P=0.003;不同磷質量濃度條件:R=0.994,P=0.006),在不同氮、磷質量濃度培養條件下該方法的測定結果準確可靠,可以用于柵藻的總脂含量測定。磷酸香草醛反應的顯色強度可能與脂肪酸的飽和度有關,為保障該方法測定總脂含量的準確性,用該方法估算總脂含量須在氮、磷質量濃度變化范圍內進行預先驗證。
 
關鍵詞:微藻;總脂含量;磷酸香草醛反應;測定方法
 
中圖分類號:TS222;Q949文獻標識碼:A
 
文章編號:1003-7969(2017)07-0120-04

Phosphoric acid-vanillin determination of total fat content of Scenedesmus 
obliquus under different cultivation conditions
ZHANG Man1, GAO Xiaolong1, ZHANG Li2, ZHU Weixia2
(1.College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China;
2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhengzhou 450003, China)
 
 
Abstract:The reliability of measuring total fat content of Scenedesmus obliquus using the phosphoric acid-vanillin reaction under different nitrogen (0.2, 2, 20, 40 mg/L) and phosphorus (0.1, 1, 10, 20 mg/L) mass concentration cultural conditions was studied. The results showed that there were significantly linear regression relationships between total fat content and absorbance value of phosphoric acid-vanillin determination under different nitrogen and phosphorus mass concentrations (different nitrogen mass concentration conditions: R=0.997, P=0003; different phosphorus mass concentration conditions: R=0.994, P=0.006). This method was accurate and reliable under different phosphorus and nitrogen mass concentrations. It could be used to determine the total fat content of Scenedesmus. The color intensity of phosphoric acid-vanillin reaction was associated with the saturation degree of fatty acids. Therefore, the range of nitrogen and phosphorus mass concentration should be verified to ensure the accuracy before using this method.
Key words:microalgae; total fat content; phosphoric acid-vanillin reaction; determination method

受能源危機的影響,微藻在生產生物能源方面的潛力備受關注[1]。藻細胞能通過光合作用將太陽能轉化為生物能,再通過不同的加工過程生產各種生物燃料。與其他油料作物相比,微藻具有生長速度快、產能高、油脂含量高、抗極端條件能力強等特點[2]。微藻生產的油脂具有產量高、品性好、易于調控和改良等多重優勢,目前對于微藻油脂的研究多集中在提高微藻含油量的方法上[3]。但現今微藻生物燃料生產仍面臨多重技術困難。其中,對微藻粗脂肪含量的傳統測定方法冗繁復雜,是微藻能源開發過程中亟待解決的問題之一[4]。特別是在微藻培養過程的連續監測中,總脂含量測定往往所需藻液體積大,操作復雜費時,不利于培養者及時掌握微藻實時脂肪積累情況。
 
生物體與磷酸香草醛試劑反應,可以產生一種紅色物質,這是磷酸香草醛反應可以用于測定總脂含量的基礎。推測認為試劑中的磷酸與香草醛的羥基作用后產生芳香族磷酸酯,并且改變了香草醛分子中的電子分配,使醛基變成酯基;另一方面,不飽和脂肪酸與硫酸作用可以水解生成碳鎓離子。磷酸酯與碳鎓離子發生反應,最終生成紅色醌化物,在530nm處存在最大吸收峰,根據顏色深淺(吸光度)即可定性分析總脂含量的高低。但是需要指出,磷酸香草醛反應的顯色強度與脂肪酸的飽和程度有關,也就是說只有在微藻不飽和脂肪酸占總脂含量比例(即脂肪酸飽和度)變化不大的前提下,用磷酸香草醛反應估算總脂含量才是可靠的。李仁民等[5]利用磷酸香草醛反應估算酵母菌的油脂含量。羅瑋等[6]也利用磷酸香草醛反應成功估算了豐富柵藻、小球藻、小環藻等多種微藻的油脂含量。
 
然而,微藻的脂肪酸飽和度在不同氮、磷質量濃度培養條件下可能會受到影響[7-8]。研究[9-10]顯示,微藻在缺氮狀態下,自身的生長(即蛋白質和核酸合成)受到限制,但其碳同化的過程一直進行,從而進入脂類代謝,提高了甘油三酯含量。有研究[11-12]進一步指出,微藻從氮源正常培養到氮源受限培養,油脂組成也會由富含游離脂肪酸變為甘油三酯。柵藻屬是常見的淡水綠藻,生長快速,能大量合成油脂,已成為開辟生物燃料的首選原料。Chen等[13]研究表明通過分批式培養28d,柵藻的平均生物量產率可達0.105g/(L·d)(干重),最高油脂含量可達干重的35%。本文利用四尾柵藻(Scenedesmusobliquus)開展研究,擬通過磷酸香草醛法建立一種快速、高效且靈敏的分析微藻總脂含量的測定方法,用以替代有機溶劑提取法煩瑣過程,為實現微藻總脂含量的測定以及用于新能源生產奠定基礎。
 
1材料與方法
 
1.1實驗材料
 
實驗藻種采用已在水體中成功分離生長迅速的四尾柵藻活性藻株。以HGZ作為微藻的培養基[14],進行種子液制備。
 
HGZ培養基配方:NaNO30.3g/L,KNO30.051g/L,K2HPO40.049g/L,MgSO4·7H2O0.075g/L,Na2CO30.02g/L,Ca(NO3)2·4H2O0.059g/L,NH4Cl-EDTA0.0391g/L,HBO32.86mg/L,MnCl2·4H2O1.81mg/L,ZnSO4·7H2O0.222mg/L,Na2MoO4·2H2O0.391mg/L,CuSO4·5H2O0.079mg/L,Fe-EDTA0.932mg/L。
 
1.2實驗方法
 
1.2.1四尾柵藻的培養
 
使用調整氮(NaNO3)、磷(K2HPO4)后的HGZ培養基配方對四尾柵藻進行為期14d的培養。實驗分別設置4個磷質量濃度處理組(1~4)和4個氮質量濃度處理組(5~8),詳見表1,每處理組設置3個平行。
 
 
 
 
實驗開始前,取處于穩定生長期的柵藻母液(濃度>109個/mL)離心收集藻細胞,用不含氮、磷源的培養基重新懸浮,待接種。將氮、磷質量濃度配制好的液體培養基置于1L錐形瓶中進行2h的高壓滅菌,冷卻后按照1.2×106個/mL的初始濃度進行接種,置于培養箱中進行為期14d的培養,光照條件為60μmol/(m2·s),培養溫度為25℃。收集培養結束的藻液,一部分用磷酸香草醛法測定總脂含量,其余藻液測定體積后置于50mL離心管中,10000r/min離心3min后棄上清,并用蒸餾水洗滌2次,將藻泥冷凍干燥2h,干燥后的藻粉用標準方法測定微藻脂肪含量。
 
1.2.2標準方法測定柵藻總脂含量
 
取100mg藻粉加入2mL10%二甲亞砜-甲醇溶液,分別于50℃抽提30min、冰浴抽提30min后,離心收集上清液于預先烘干的玻璃小瓶中,藻渣加入4mL乙醚-正己烷(體積比1∶1),冰浴抽提1h,離心收集上清液至同一玻璃小瓶中,重復上述過程直到藻渣變白。在合并的抽提液中加入純水,使二甲亞砜-甲醇、水、乙醚、正己烷的比例為1∶1∶1∶1(體積比),振蕩分相,移取有機相至另一玻璃小瓶中,在通風櫥中用氮氣吹至較小體積,將濃縮液轉移至預先稱重的1.5mL塑料離心管中,用氮氣吹干至恒重,即得總脂含量[15]。
 
1.2.3磷酸香草醛法測定柵藻總脂含量
 
磷酸香草醛試劑:0.12g香草醛溶解于20mL蒸餾水中,用85%的磷酸定容至100mL。
 
測定方法:將培養濃度大于106個/mL的藻液取出,準確量取體積1mL,于10000r/min離心5min,用蒸餾水重新定容至1mL(以蒸餾水為參照),加入10mL具塞比色管中,加入2mL18mol/LH2SO4,于沸水浴中孵化10min,常溫水浴孵化10min,加5mL磷酸香草醛試劑,37℃保溫15min,再常溫水浴10min,于530nm處測定吸光度。
 
1.2.4數據分析
 
取平行樣品的均值作相關分析的計算。用Pearson相關分析被測指標之間的相關系數。設定P<0.05具有顯著差異。數據用“平均值±標準差”表示,用統計分析軟件SPSS16.0進行線性回歸分析。用Excel軟件進行數據錄入和基本作圖。
 
2結果與分析
 
2.1磷酸香草醛測定吸光度與標準法測定總脂含量(見表2、圖1)
 
 
 
從表2、圖1可以看出,在收獲末期,磷酸香草醛法測定的吸光度(y)和末期柵藻濃度(x)之間存在顯著的線性相關關系(y=0.0067x-0.0009,R=0.963,P<0.001),表明在培養條件范圍內,磷酸香草醛法測定的脂肪酸濃度和末期柵藻濃度呈正比。標準方法測定總脂含量(y)與末期柵藻濃度(x)也呈顯著的線性相關關系(y=2.1481x-0.2442,R=0.934,P=0.001),表明總脂含量和末期柵藻濃度呈正比。
 
2.2磷酸香草醛法測定不同氮、磷質量濃度條件下柵藻油脂含量
 
從表2可以看出,隨著氮、磷質量濃度增高,總脂含量均隨之增加。在不同磷質量濃度條件下,磷酸香草醛法測定的吸光度(x)與標準方法測定總脂含量(y)之間存在顯著的線性相關關系(y=326.2x+0.056,R=0.994,P=0.006)。在不同氮質量濃度條件下,磷酸香草醛法測定的吸光度(x)與標準方法測定總脂含量(y)之間也存在顯著的線性相關關系(y=314.2x-0.104,R=0.997,P=0.003)。綜合不同氮、磷質量濃度培養條件來看,磷酸香草醛法測定的吸光度(x)和標準方法測定總脂含量(y)之間也存在顯著的線性相關關系(y=326.23x-01821,R=0.994,P=0.000),表明磷酸香草醛法用于測定柵藻總脂含量具有可行性。
 
3結論
 
本文利用磷酸香草醛反應測定了四尾柵藻總脂含量,結果表明在不同磷、氮質量濃度條件下該方法的測定結果準確可靠,可以用于在該培養條件下柵藻的總脂含量測定。
 
與磷質量濃度培養條件變化相比,在不同氮質量濃度條件下柵藻總脂含量和磷酸香草醛測定吸光度之間線性回歸的斜率相近,綜合不同氮、磷質量濃度培養條件來看,柵藻總脂含量和磷酸香草醛法測定吸光度之間線性關系顯著,這表明在不同氮、磷質量濃度條件下,利用磷酸香草醛反應的顯色強度測定總脂含量是準確可靠的。本研究中,根據磷酸香草醛反應的原理,只要柵藻中不飽和脂肪酸占總脂含量的比例不發生變化或變化不大,利用該反應測定藻類總脂含量就是可行的。推測本實驗中,柵藻在不同氮、磷質量濃度條件下,油脂中不飽和脂肪酸含量變化不大,這是利用磷酸香草醛反應成功測定總脂含量的主要原因。利用磷酸香草醛反應進行藻類總脂測定的過程中不需要復雜的實驗儀器,測定方法快速準確,特別適用于大規模分析及連續監測。但磷酸香草醛反應的顯色強度與脂肪酸的飽和度有關,用磷酸香草醛反應估算總脂含量需要進行預先驗證才是可靠的。正確利用該方法能夠快速測定微藻總脂含量,為能源微藻總脂測定開辟了一種新的途徑。

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