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米曲霉脂肪酶催化魚油酯酯交換制備高含量EPA/DHA甘油酯的研究

發布日期:2017-10-23 11:37來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 鄭建永1,2,張石自1,王升帆2,李俊1,汪釗1
 
(1.浙江工業大學生物工程學院,浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室,杭州310014;
 
2.浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠,浙江新昌312500)
 
摘要:利用米曲霉脂肪酶催化甘油酯型魚油和乙酯型魚油的酯酯交換反應制備高含量EPA/DHA甘油酯,考察了底物摩爾比、反應溫度、酶添加量和搖床轉速對酶催化反應的影響,得到了最優酶催化反應條件:甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3,酶添加量14%,反應溫度70℃,搖床轉速150r/min。在最優的酶催化反應條件下反應18h,產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量可達到39.72%。在優化條件下對米曲霉WZ007菌絲體重復使用6次,甘油酯型魚油產品中的EPA和DHA含量仍保持在34.51%。
 
關鍵詞:脂肪酶;魚油;EPA;DHA;酯酯交換;米曲霉
 
中圖分類號:TS221;TQ644.3文獻標識碼:A
 
文章編號:1003-7969(2017)07-0111-04

Preparation of high content EPA/DHA glycerides from transesterification of
fish oil catalyzed by Aspergillus oryzae lipase
ZHENG Jianyong1,2,ZHANG Shizi1,WANG Shengfan2,
LI Jun1,WANG Zhao1
(1.Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and 
Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 
2.Xinchang Pharmaceutical Factory, Zhejiang Medicine Co., Ltd., Xinchang 312500, Zhejiang, China)
 
 
Abstract:The preparation of high content EPA/DHA glycerides form transesterification of ethyl ester-type fish oil and glyceride-type fish oil catalyzed by Aspergillus oryzae lipase was studied. The effects of molar ratio of substrate, reaction temperature, enzyme dosage and rotation speed on the reaction were investigated. The optimal enzymatic transesterification conditions were obtained as follows: molar ratio of glyceride-type fish oil to ethyl ester-type fish oil 1∶ 3, enzyme dosage 14%, reaction temperature 70 ℃ and rotation speed 150 r/min. Under the optimal conditions, the content of EPA and DHA in the glyceride-type fish oil product could reach 39.72% after reaction for 18 h. When Aspergillus oryzae WZ007 mycelium was reused for six batches, the content of EPA and DHA in the glyceride-type fish oil product kept above 34.51% in every batch.
Key words:lipase; fish oil; EPA; DHA; transesterification; Aspergillus oryzae

脂肪酶廣泛存在于自然界中,包括動物、植物和微生物,例如在人和動物體內,各類脂肪酶的功能主要是控制消化、吸收和脂蛋白代謝等過程[1-3]。微生物脂肪酶主要來源于細菌和真菌,由于其來源廣泛、生產周期短、易于生產,細菌胞外脂肪酶被廣泛應用于食品、香料、清潔劑、手性醫藥中間體和其他一些化學品的生產中[4-5]。傳統的物理化學法制備高含量EPA和DHA甘油酯的方法包括低溫結晶法,金屬鹽沉淀法和超臨界流體萃取法[6]。與物理化學法相比,微生物酶法具有催化效率高、選擇性高,在工業化生產中能耗低等優勢[7];微生物酶法反應條件溫和,對n-3PUFA的結構不會造成破壞[8]。酶催化反應可在無溶劑體系中進行,從而避免了龐大的生產設備,生產安全系數更高。目前有關酶法酯酯交換的研究報道較少,國內有學者在這方面有所研究。郭正霞等[9]利用國產固定化假絲酵母脂肪酶催化甘油酯型魚油和乙酯型魚油酯酯交換,制備高PUFA含量的甘油酯型魚油,優化條件下得到的甘油三酯中DHA和EPA的含量分別為13.10%和33.40%。宋詩軍等[10]以酶催化選擇性醇解反應得到的混合甘油酯和乙酯魚油為原料,加入底物質量2%的Novozym435為催化劑,在100Pa真空條件下,60℃磁力攪拌6h,產物經過分子蒸餾處理后,得到以甘油三酯為主的產品,其中DHA和EPA含量分別為28.6%和40.4%。近年來酶法催化富集n-3PUFA的方法越來越受到關注[11-12],但是研究通常采用商品化脂肪酶作為催化劑,存在酶的價格昂貴和使用成本較高等問題。因此,本課題組利用具有自主知識產權的高活性全細胞脂肪酶催化制備富集n-3PUFA產品,降低了成本,具有重要的理論意義和應用價值。
 
利用實驗室保藏的米曲霉WZ007菌絲體所含脂肪酶催化甘油酯型魚油和乙酯型魚油的酯酯交換反應制備高含量EPA和DHA甘油酯,并對各因素對酶催化反應的影響進行研究。
 
1材料與方法
 
1.1試驗材料
 
1.1.1原料與試劑
 
甘油酯型魚油(EPA含量11.5%,DHA含量14.5%)、乙酯型魚油(EPA含量26.0%,DHA含量21.5%),由浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠提供。正己烷等化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。米曲霉WZ007菌株(中國典型培養物保藏中心,保藏號CCTCCM206105)為本實驗室保藏菌株。
 
1.1.2儀器與設備
 
Agilent6890氣相色譜儀,AvantiJ-E高速冷凍離心機,B2-2FA2004電子分析天平,ALPHA2-4LDplus真空冷凍干燥機,HWY-2112恒溫水浴搖床等。
 
1.2試驗方法
 
1.2.1米曲霉菌絲體的制備
 
米曲霉WZ007發酵培養基組成:蛋白胨20g/L,橄欖油10mL/L,KH2PO41g/L,MgSO40.5g/L,NaCl0.5g/L,pH自然。在30L發酵罐中進行發酵培養,溫度30℃和轉速200r/min條件下培養36h后,過濾除去培養液,用蒸餾水洗滌數次后收集菌絲體,濾干蒸餾水后加入少量磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L,pH7.0)浸泡,在-60℃條件下真空冷凍干燥48h,將米曲霉菌絲體4℃冰箱保存備用。
 
1.2.2酶催化酯酯交換反應
 
在50mL磨口具塞三角瓶中加入一定量的甘油酯型魚油和乙酯型魚油(總質量10g),一定量的米曲霉菌絲體,用保鮮膜密封,置于一定溫度和轉速的恒溫水浴搖床上,開始反應,定時取樣氣相色譜分析產物中乙酯型魚油EPA和DHA的含量。
 
1.2.3產物中EPA和DHA含量計算
 
產物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量(Y)由下式計算。
 
 
式中:X1和X2分別表示反應前和反應后乙酯型魚油EPA和DHA的總含量;n(EE)和n(TAGs)分別表示原料中乙酯型魚油和甘油酯型魚油的物質的量;Y1表示原料甘油酯中EPA和DHA的總含量,在本試驗中為26.0%。
 
2結果與討論
 
2.1底物摩爾比對酶催化酯酯交換反應的影響
 
反應底物總質量為10g,甘油酯型魚油與乙酯型魚油的摩爾比范圍為1∶1~1∶4.5,酶添加量為底物總質量的10%(即1g,每個樣品3個平行),于50mL磨口具塞三角瓶。在30℃,200r/min水浴搖床中反應18h,氣相色譜檢測產物中乙酯型魚油EPA和DHA含量,并計算產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量,結果如圖1所示。
 
 
由圖1可知,產物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量隨著甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比的增大而緩慢增加,當底物摩爾比增大到1∶3.5以后,甘油酯型EPA和DHA的含量基本不變,說明此時反應達到平衡。綜合考慮后續分離的能耗,選擇甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3作為后續試驗的反應底物摩爾比。
 
2.2反應溫度對酶催化酯酯交換反應的影響
 
反應底物甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3,酶添加量10%,于50mL磨口具塞三角瓶??刂品磻獪囟确謩e為30、40、50、55、60、65、70℃和75℃,搖床轉速200r/min,反應時間18h。氣相色譜檢測產物中乙酯型魚油EPA和DHA含量,并計算產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量,結果如圖2所示。
 
 
由圖2可知,產物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量隨反應溫度的升高而增加,說明隨著反應溫度的升高,脂肪酶的活性緩慢提高,并在70℃時,甘油酯型EPA和DHA含量達到最大值(36.61%),當反應溫度繼續升高到75℃時,甘油酯型魚油EPA和DHA含量沒有繼續增加,說明米曲霉WZ007菌絲體在反應體系中具有很好的熱穩定性。綜合考慮熱量的能耗,選擇70℃為后續試驗的反應溫度。
 
2.3酶添加量對酶催化酯酯交換反應的影響
 
反應底物甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3,酶添加量分別為10%、12%、14%、16%和18%,于50mL磨口具塞三角瓶。反應溫度70℃,搖床轉速200r/min,反應時間18h。氣相色譜檢測產物中乙酯型魚油的EPA和DHA含量,計算產物甘油酯型魚油的EPA和DHA含量,結果如圖3所示。
 
 
 
由圖3可知,當酶添加量從底物質量的10%上升到14%時,產物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量隨酶添加量的增加而增大。當酶添加量為14%時,甘油酯型魚油EPA和DHA含量達到最大,為39.32%。繼續增加酶添加量,反應體系變得黏稠,傳質受阻,甘油酯型魚油EPA和DHA的含量反而降低。因此,選擇14%為后續試驗的酶添加量。
 
2.4搖床轉速對酶催化酯酯交換反應的影響
 
在50mL具塞三角瓶中加入甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3,酶添加量14%,控制搖床轉速分別為100、150、200、250r/min和300r/min,反應溫度70℃,反應時間18h。氣相色譜檢測產物中乙酯型魚油EPA和DHA含量,計算產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量,結果如圖4所示。
 
 
由圖4可知,當搖床轉速從100r/min上升到150r/min時,甘油酯型魚油EPA和DHA含量有所增加,說明增大搖床轉速對體系的傳質傳熱起到了促進作用,搖床轉速從150r/min增加到300r/min的過程中,甘油酯型魚油EPA和DHA含量無明顯變化??赡苁求w系的傳質阻力幾乎消失,從節省機械能耗方面考慮選擇150r/min為后續試驗的搖床轉速。酶催化酯酯交換反應的所需轉速較低,其原因可能是甘油酯型魚油和乙酯型魚油具有良好的溶解性,底物的傳質比較容易。
 
2.5酶催化酯酯交換的反應時間曲線
 
在優化后的條件下(甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3,酶添加量14%,反應溫度70℃,搖床轉速150r/min)進行酶催化酯酯交換反應,定時取樣氣相色譜檢測產物中乙酯型魚油EPA和DHA含量,計算產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量,繪制反應時間曲線,結果如圖5所示。
 
 
 
由圖5可知,在優化條件下反應0~12h時間范圍,甘油酯型魚油EPA和DHA含量迅速增加,12~18h時間范圍仍維持一定的反應速度。反應時間為18h產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量為39.72%,18~30h時間范圍反應緩慢進行,甘油酯型魚油EPA和DHA含量到達41.13%,30h以后反應趨于平衡,甘油酯型魚油EPA和DHA含量幾乎不變,整個反應過程中EPA和DHA含量的最大值為41.78%(48h),與原料甘油酯型魚油相比,產物甘油酯型魚油中EPA和DHA含量有明顯提高。
 
2.6酶的重復使用情況
 
在上述優化條件下,酶催化反應12h,當反應結束后,直接離心回收米曲霉菌絲體,用少量丙酮沖洗,除去菌體上殘留的底物和產物,進行10批次重復反應。氣相色譜檢測產物中乙酯型魚油EPA和DHA含量,計算產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量,結果如圖6所示。
 
 
由圖6可知,第1批反應12h甘油酯型魚油EPA和DHA含量為38.84%,米曲霉菌絲體重復使用6次,甘油酯型魚油EPA和DHA含量為34.51%。米曲霉菌絲體重復使用10次,甘油酯型魚油EPA和DHA含量為33.2%,高于進口甘油酯型魚油EPA和DHA含量30%的水平。重復批次反應過程中甘油酯型魚油EPA和DHA含量逐漸降低,其原因可能是長時間處于較高溫度使酶變性失活,或者是洗滌步驟造成細胞的脂肪酶蛋白流失??傮w而言,米曲霉WZ007菌絲體具有較好的操作穩定性,可以重復使用,將大大降低其應用成本。
 
3結論
 
利用米曲霉WZ007菌絲體脂肪酶催化乙酯型魚油(EPA和DHA含量47.5%)和甘油酯型魚油(EPA和DHA含量26.0%)酯酯交換反應,重點考察了底物摩爾比、反應溫度、酶添加量和搖床轉速等因素對反應的影響。試驗得到了優化的工藝條件:甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3,酶添加量為底物總質量的14%,反應溫度70℃,搖床轉速150r/min。在優化的條件下,酶催化反應18h,產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量可達到39.72%,反應48h,產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量為41.78%。在優化條件下,米曲霉WZ007菌絲體重復使用6次,產物甘油酯型魚油EPA和DHA含量仍保持在34.51%。試驗結果表明,米曲霉WZ007催化制備高含量EPA和DHA甘油酯型魚油產品具有較強的工業化應用潛力。

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