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不同溶藻菌對小球藻破碎及油脂提取效果的影響

發布日期:2017-10-23 11:29來源:中國油脂網作者:未知點擊次數:
 鄧春芳,崔巖,章瑩穎,成家楊
 
(北京大學深圳研究生院環境與能源學院,廣東深圳518055)
 
摘要:為探究溶藻菌對微藻細胞破碎及油脂提取效果的影響,以小球藻為研究對象,選取5株溶藻菌進行混合培養。結果表明:不同溶藻菌對小球藻細胞破碎及油脂提取效果各不相同。不同溶藻菌的溶藻率依次為:Aeromonahydrophila(73%)>Pseudomonasflurescens(65%)>Bowmanelladenitrificans(56%)、Bacilluscirulans(56%)>Kordiasp.(43%)。利用正己烷對小球藻油脂進行提取,提油率依次為:Bowmanelladenitrificans(58.4%)>Kordiasp.(52.7%)>Pseudomonasflurescens(24.1%)>Bacilluscirulans(22.5%)>Aeromonahydrophila(21.1%)>對照組(10.4%)。其中Bowmanelladenitrificans菌株在24h內就能達到高溶藻率,且提油率相比對照組提高4.6倍。
 
關鍵詞:溶藻菌;小球藻;細胞破碎;油脂提取
 
中圖分類號:TS222+.3;TS225.6文獻標識碼:A
 
文章編號:1003-7969(2017)07-0106-05
Effects of algicidal bacteria on cell disruption and oil extraction of
microalgae Chlorella vulgaris
DENG Chunfang, CUI Yan, ZHANG Yingying, CHENG Jiayang
(School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School,
Shenzhen 518055, Guangdong, China)
 
 
Abstract:In order to investigate the effects of algicidal bacteria on the cell disruption and oil extraction of microalgae Chlorella vulgaris, with microalgae Chlorella vulgaris as the study object, five strains of algicidal bacteria Kordia sp., Bowmanella denitrificans, Aeromona hydrophila, Pseudomonas flurescens, and Bacillus cirulans were mixed cultured. The results showed that the effects of different algicidal bacteria on the cell disruption and oil extraction of microalgae Chlorella vulgaris were different.The aglae-lysing rate of Aeromona hydrophila, Pseudomonas flurescens, Bowmanella denitrificans, Bacillus cirulans and Kordia sp. were 73%, 65%, 56%, 56% and 43%, respectively. The oil was extracted from Chlorella vulgaris by n-hexane.The oil extraction rate of Bowmanella denitrificans, Kordia sp., Pseudomonas flurescens, Bacillus cirulans, Aeromona hydrophila and control group were 58.4%, 52.7%, 24.1%, 22.5%, 21.1% and 10.4%, respectively. Bowmanella denitrificans was the most potential algicidal bacterium with high aglae-lysing rate which could be reached in 24 h and the oil extraction rate was 4.6 times higher than that of the control group.
Key words:algicidal bacteria; Chlorella vulgaris; cell disruption; oil extraction
隨著經濟的快速發展,能源的需求不斷增加,能源短缺已經成為制約全球經濟發展的一個重要因素。生物柴油作為主要的生物能源之一,是一種可生物降解、無毒的可再生能源,具有環境友好、原料可再生的等優點,是當前可持續發展再生能源的研究熱點。目前生物柴油在世界各國得到了大力推進,已成為發展最快、應用最廣的環保型可再生能源。微藻是最有發展潛力的生物柴油的原料之一,具有生長繁殖快、生長周期短、油脂含量高并且不受氣候與季節限制的特點[1-3]。
 
小球藻是一種單細胞真核微藻,在自然界中分布范圍廣,對生長條件要求低,環境耐受性好,繁殖速度快,人工培養較容易,以淡水環境居多,是可進行大規模戶外培養的微藻品種之一。同時,小球藻細胞內油脂累積可高達干重的55%,主要油脂成分以C16和C18的脂肪酸甘油酯為主,與大豆等植物中提取的油脂成分相似,酯交換后得到的脂肪酸甲酯其燃燒性能與石化柴油極其相似。但其大規模生產應用還需要解決不同環節存在的技術和經濟問題,其中,研發具有高效節能的油脂提取技術是降低成本的有效途徑之一[4-6]。
 
溶藻菌是指能夠抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統稱[7]。在水生生態系統中,溶藻菌作為生物種群結構和功能的重要組成部分,對維持微藻的生物平衡具有十分重要的作用。在1942年,Geitler報道了一種能夠使剛毛藻死亡的粘細菌,之后有其他學者陸續從海洋和淡水系統中分離出多株溶藻菌[8]。主要有:粘細菌(Myxobacter)[9],交替單胞菌(Alteromonas)[10],桿菌(Bacillus)[11],假單胞菌(Pseudomonas)[12],交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)[13],葡萄球菌屬(Staphylococcus)[14],噬胞菌屬(Cytophaga)[15],纖維弧菌屬(Cellvibrio)節桿菌(Arthrobacter)[16],黃桿菌屬(Flavobacterium)弧菌(Vibrio)[17]等。這些溶藻菌大多數為革蘭氏陰性菌,溶藻目標廣泛,如藍藻、硅藻、甲藻及綠藻等。而有些則具有一定的特異性,只能對某些單一種屬的微藻產生溶藻作用。因此,不同種類的溶藻菌在目標藻種及溶藻效果方面都存在一定差異。
 
目前國內對于溶藻菌研究主要集中在生物防治有害藻華,包括溶藻菌株的分離鑒定、溶藻方式的探討以及溶藻活性物質的分離純化,而利用溶藻菌對微藻進行預處理以提高油脂提取率的研究較少。2013年Chen等[18]報道利用溶藻菌Flammeovirgayaeyamensis對小球藻進行細胞破壁預處理,小球藻油脂提取率可以達到100%。2014年Wang等[19]將溶藻菌Sagittulastellata和兩種微藻(Nannochloropsisoculata、Dunaliellasalina)分別進行混合共培養,得到油脂提取率相比對照分別提高1.39倍和1.85倍。章瑩穎等[20]通過比較不同破碎方法對微藻細胞破碎和油脂提取效果的影響,發現溶藻菌不僅具有較好的細胞破碎效果,且能提高油脂提取率。因此,本研究以小球藻為研究對象,選取5株已報道過具有較強溶藻效果的細菌與小球藻進行混合培養,探究溶藻菌對微藻細胞破碎及油脂提取效果的影響。
 
1材料與方法
 
1.1試驗材料
 
1.1.1藻種
 
小球藻由實驗室自主采集及分離,采用BG-11培養基進行搖瓶培養,其配方為:在1L水中加入Na2EDTA0.001g,檸檬酸鐵銨0.006g,檸檬酸0.006g,CaCl2·2H2O0.036g,MgSO4·7H2O0.075g,K2HPO4·3H2O0.04g,H3BO30.00286g,MnCl2·4H2O0.00186g,ZnSO4·7H2O0.000222g,CuSO4·5H2O0.000079g,Co(NO3)2·6H2O0.00005g,Na2MoO4·2H2O0.000391g,Na2CO30.02g,NaNO31.5g。
 
1.1.2溶藻菌
 
試驗中的5株溶藻菌從國內具有資質認證的微生物菌種保藏管理中心獲得,如表1所示。表1中菌株在文中依次簡稱為Kordia、Bowmanella、Aeromona、Pseudomonas、Bacillus,相應圖表中分別用Kor、Bow、Aer、Pse、Bac表示。
 
表1試驗菌種來源
 
 
其中溶藻菌Kordia、Bowmanella、Aeromona均采用LB培養基進行培養,其配方為:1L水中加入胰蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g,氯化鈉10.0g。Pseudomonas培養基采用菌種庫提供配方:在1L水中加入蛋白胨5.0g,牛肉浸取物3.0g,氯化鈉5.0g。Bacillus培養基采用菌種庫提供配方:在1L水中加入蛋白胨5.0g,牛肉浸取物3.0g,氯化鈉5.0g,MnSO4·H2O5.0mg。
 
1.1.3儀器與試劑
 
TS-2102GZ光照搖床,RF5301立式壓力蒸汽滅菌器,RF5301熒光光度計,AL104電子天平,BX-53熒光顯微鏡,pH計,DHG-9053A烘箱,水浴鍋,RV10旋轉蒸發儀,UV-1800可見分光光度計,離心機,血球計數板(16格×25格),S-4800場發射掃描電子顯微鏡。
 
正己烷(色譜純),丙酮(色譜純),尼羅紅,戊二醛(分析純)。
 
1.2試驗方法
 
小球藻在溫度26℃、轉速120r/min,光暗比12h∶12h的搖床里進行培養,每間隔24h測定藻細胞濃度、光密度(OD值)和相對熒光強度。將培養至對數期的溶藻菌與小球藻按體積比1∶1進行混合,置于避光搖床(30℃、120r/min)中,通過定期觀察微藻細胞的破碎情況,測定最終提油率,探究5株溶藻菌對小球藻破碎及油脂提取效果的影響。
 
1.2.1OD值和相對熒光強度的測定
 
OD值:利用可見分光光度計測定藻活體細胞在最大吸收波長680nm處的吸光值和5株溶藻菌在最大吸收波長600nm處的吸光值。
 
藻細胞相對熒光強度測定:取4mL藻液,8000r/min離心10min,棄上清液,用PBS緩沖液重懸,加入12μL尼羅紅丙酮溶液進行染色,利用熒光光度計在激發波長480nm、400~700nm內掃描,峰值為吸收強度[21]。
 
1.2.2藻細胞濃度的測定及溶藻率計算
 
藻細胞濃度:利用血球板計數法在顯微鏡下對完整微藻細胞進行計數。
 
為直觀反映溶藻菌的溶藻效果,引用溶藻率作為評價指標,其計算公式如下:
 
溶藻率=(Ni-Nf)/Ni×100%
 
(1)
 
式中:Ni為藻細胞原始個數,Nf為經過破碎后完整藻細胞個數。
 
1.2.3提油率計算
 
小球藻油脂提取采用有機溶劑(正己烷)浸提法:取藻菌混合液120mL(菌藻各60mL)分裝于6個50mL的離心管,按1∶1的比例加入正己烷,在150r/min搖床過夜,12h后,進行離心(4000r/min,15min),收集上清液。將收集的上清液進行蒸餾分離(蒸餾瓶100mL,溫度45℃,轉速110r/min),在65℃烘箱中干燥1.5h后稱重(烘箱提前預熱)。
 
提油率計算公式如下:
 
提油率=W2/WD×100%
 
(2)
 
式中:W2為提取油質量;WD為細胞干重,其測定方法為取60mL藻液于已稱重離心管(W0)中,在4000r/min條件下離心10min,去上清液,在真空冷凍干燥機干燥12h后稱重(W1),WD=W1-W0。
 
1.2.4掃描電鏡分析
 
取15mL樣品,在離心機中離心10min(2800r/min),棄去上清液,留下絮狀物,即刻在離心管中加入2.5%戊二醛固定液進行固定,12h后用微孔濾膜截留樣品,再用pH7.0的磷酸緩沖溶液清洗2h。然后經乙醇上升梯度脫水,其順序為30%、50%、70%、80%和90%,每梯度各1次,每次15min,100%乙醇脫水3次,每次15min,放入-20℃冰箱12h,再放入-80℃冰箱4h,之后在冷凍干燥機中干燥24h。將預處理完的樣品在場發射掃描電子顯微鏡進行觀察拍照。
 
2結果與討論
 
2.1小球藻生長情況
 
為選取最優時間點進行小球藻收獲,本試驗通過可見分光光度計和熒光光度計分別測定OD680和相對熒光強度來表征小球藻生長和油脂積累情況,結果見圖1。
 
 
由圖1可知,在培養時間1~15d內,小球藻的OD680和相對熒光強度隨時間的延長而逐漸增大,在15d時,OD680為1.216,相對熒光強度達到最大值56.868。此后OD680仍逐漸增大,相對熒光強度緩慢減小。由此可知,微藻細胞內油脂含量會隨著培養時間的延長逐漸積累,到一定階段油脂總量達到穩定值。因而本試驗選取培養至15d的小球藻進行試驗研究。
 
2.2溶藻菌的生長情況
 
溶藻菌的生長曲線如圖2所示。
 
 
由圖2可知,5株溶藻菌在接種后的0~4h處于延滯期,4~24h處于對數生長期,24h后進入穩定期。為使溶藻菌的溶藻效果達到最優,本試驗選取了培養至24h的溶藻菌進行混合培養試驗。
 
2.3不同溶藻菌的溶藻效果研究
 
將溶藻菌和小球藻進行混合培養,每隔24h取樣計數完整藻細胞,溶藻率計算結果如圖3所示。
 
 
由圖3可知,5株溶藻菌對小球藻均具有良好的溶藻效果,且溶藻率隨著時間的延長而逐漸增大。在本試驗中藻菌混合培養至96h時,5株溶藻菌的溶藻率均達到最高,依次為Aeromona(73%)>Pseudomonas(65%)>Bowmanella(56%)、Bacillus(56%)>Kordia(43%)。在混合24h時,Bowmanella溶藻率迅速升高,較于其他4個菌種最高(47%),說明該菌種對小球藻具有較強攻擊性,能達到迅速溶藻效果。Aeromona在混合24h時溶藻率最低,但在72h內溶藻率呈現線性增長趨勢,從14%增長到65%,說明該菌株需要對環境的適應,一旦適應環境后可迅速達到較好的溶藻效果。Bacillus,Kordia和Pseudomonas在藻菌混合后溶藻率變化趨勢相似,即溶藻率在48h內迅速增長,之后呈現緩慢增長的趨勢。
 
溶藻率試驗結果表明:不同溶藻菌對小球藻的適應能力和攻擊能力呈現差異性。結合5菌株的生物安全性,以及時間和管理成本,能在短時間內達到較好溶藻效果的Bowmanella菌株將更具有實際應用潛力。
 
2.4掃描電鏡分析
 
為進一步分析小球藻和溶藻菌細胞結構所發生的變化,采用掃描電鏡對共培養4d后的藻菌混合液進行觀察,結果如圖4所示。由圖4可知,未經處理的小球藻形態完好,表面光滑,細胞結構完整,呈橢圓形。而經不同溶藻菌處理后的小球藻在視野范圍內觀察不到完整的藻細胞,細胞壁破碎,體積變小,發生了不同程度的變形和破壞。直觀判斷加入Aeromona和Pseudomonas溶藻菌后的小球藻的藻細胞結構破壞最嚴重,藻細胞整體變小,細胞結構發生重度變形,有網狀結構和孔隙。掃描電鏡圖進一步說明了溶藻菌的破碎作用,至于溶藻菌對藻細胞表面結構的破壞性不同可能與它們分泌的溶藻物質不同有關,具體的溶藻機理有待于進一步深入研究。
 
 
 
2.5不同溶藻菌的油脂提取效果研究
 
試驗采用有機溶劑浸提法對溶藻菌處理之后的微藻細胞進行油脂提取。為了排除溶藻菌對最后提油效果的影響,采用正己烷浸提法對5株溶藻菌分別進行油脂提取的預試驗。結果表明,5株溶藻菌均無油脂提取出來。說明采用此方法提取的藻菌混合液中的油脂均來源于小球藻。
 
對5株溶藻菌處理前后的小球藻進行油脂提取,所得結果如圖5所示。
 
 
由圖5可知,小球藻的提油率依次為:Bowmanella(58.4%)>Kordia(52.7%)>Pseudomonas(24.1%)>Bacillus(22.5%)>Aeromona(21.1%)>對照組(10.4%,對照組為未經溶藻菌處理的小球藻)。由此可知,采用溶藻菌進行預處理對小球藻油脂提取有明顯的促進作用。其中Bowmanella和Kordia對小球藻的提油率相對于對照組分別提高了4.6倍和4.1倍,另外3株菌Aeromona、Pseudomonas、Bacillus對小球藻的提油率較對照組均提高1倍以上。
 
Lenneman等[22]將自主分離的溶藻菌(AeromonashydrophilaAD9)與兩種微藻(Dunaliellatertiolecta,Neochlorisoleoabundans)分別進行混合培養,利用正己烷進行油脂提取,其提油率相比未經溶藻菌處理的對照組分別提高12倍和6倍。試驗結果表明,溶藻菌對微藻細胞的油脂提取有促進作用,但提油率的高低與微藻細胞以及菌種的選擇有直接關系。雖然利用溶藻菌降解藻細胞相對于傳統的機械和化學方法具有較好的經濟效益,但溶藻菌對微藻細胞具有選擇特異性,菌的接種量需要嚴格控制,否則很難達到預期效果[23]。
 
3結論
 
綜合溶藻率和提油率可知,Bowmanelladenitrificans是5株溶藻菌中最具應用潛力的菌株。因其不僅可在短時間內達到高溶藻率,且油脂提取率最高,可以同時滿足對時間成本和技術成本的要求。5株溶藻菌對小球藻油脂的提取均有明顯的促進作用,為開發高效、低能耗的生物油脂生產工藝提供了部分理論依據。
 
雖然本研究初步證實了溶藻菌應用于微藻油脂的提取是可行的,但藻菌之間的作用方式和作用機理仍未清楚,有待進一步深入研究。此外,由于溶藻菌對微藻具有選擇特異性,所以關于溶藻菌和藻種的選擇、菌用量的控制以及對溶藻時間點的把握都是后續一系列可開展的工作。
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