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尿素包合法富集苦瓜籽油中α-桐酸的工藝優化

發布日期:2022-04-12 11:53來源:中國油脂作者:帥曉艷(lkmoo)點擊次數:

苦瓜(Momordica charantia L,MC),是葫蘆科(Cueurbitaeeae)苦瓜屬草本植物果實,作為一種藥食同源性瓜果,在我國已有上千年的栽培食用歷史,其營養價值在所有葫蘆科植物中排名第一\[1\],具有抗腫瘤、降低膽固醇等多種生物功效\[2\]??喙献讶手泻卸嗵?、皂苷等生物活性成分,其蛋白質含量高達39%~45%\[3\]??喙献讶手泻写罅坑椭?,占苦瓜籽總質量的25%以上\[4\]??喙献延透缓曹梺喡樗幔–LN),尤其含有大量α-桐酸(CLN的一種)\[5\]。共軛亞麻酸是一組在C9,11,13位具有雙鍵的十八碳三烯酸的同分異構體,其天然存在于極少數反芻動物體內和植物種子油中,且主要以甘油三酯的形式存在。近年來,許多研究表明共軛亞麻酸具有減肥\[6\]、抗癌\[7\]、抗糖尿病\[8\]和調節肝脂代謝\[9\]等多種生理功能??喙献延妥鳛闉閿挡欢嗟母缓?桐酸的可食用植物油來源之一,具有良好的應用開發價值。當前,對苦瓜及苦瓜籽中生物活性物質的分離純化研究多集中于活性多肽、多糖和皂苷等成分,而對功能性脂肪酸分離方面的研究報道較少。脂肪酸分離純化方法主要包括蒸餾法、尿素包合法、低溫結晶法、高速逆流色譜法、脂肪酶輔助法、超臨界CO2萃取法、分子蒸餾法等 \[10\]。與其他方法相比,尿素包合法操作簡單,試驗條件溫和,成本低且無污染。本試驗以超臨界CO2萃取的苦瓜籽油為原料,采用皂化酸解法制得混合脂肪酸,再利用尿素包合法對α-桐酸進行富集,分析富集前后的脂肪酸組成及含量,以期為苦瓜籽油的深度開發和綜合利用研究提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料苦瓜籽油(超臨界CO2萃取所得),運鴻集團股份有限公司提供;氫氧化鉀、95%乙醇、石油醚(30~60 ℃)、鹽酸、無水硫酸鈉、尿素等,均為分析純;甲醇、正己烷,均為色譜級,美國Fisher公司;α-桐酸標準溶液(5 mg/mL),上海甄準生物公司。PF-101T集熱式恒溫磁力攪拌器;R3旋轉蒸發儀,瑞士 Buchi 公司;YR-PTB真空泵;AL204電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PCR-B-SF-10 超純水機;7890A-5975C氣相色譜質譜聯用儀,美國Agilent公司。

1.2試驗方法

1.2.1苦瓜籽油理化指標測定相對密度,參照GB 5009.2—2016進行測定;酸值,參照GB 5009.229—2016進行測定;碘值,參照GB/T 5532—2008進行測定;過氧化值,參照GB 5009.227—2016進行測定;皂化值,參照GB/T 5534—2008進行測定。

1.2.2苦瓜籽油混合脂肪酸的制備準確稱取4 g左右苦瓜籽油于燒瓶中,加入0.5 mol/L氫氧化鉀乙醇溶液20 mL,于70 ℃下磁力攪拌回流1.5 h。冷卻至室溫,加入2 mL蒸餾水后用石油醚萃取3次,除去溶液中的不皂化物。底層溶液用2 mol/L HCl調節pH至2~3,用石油醚萃取3次后合并有機相,用無水硫酸鈉脫水,旋轉蒸發除去石油醚后得到苦瓜籽油混合脂肪酸。     

1.2.3尿素包合法富集α-桐酸參照文獻\[11-12\],尿素中加入一定量溶劑(95%甲醇或95%乙醇),于75 ℃水浴下加熱回流并磁力攪拌至尿素溶解完全,然后加入一定量苦瓜籽油混合脂肪酸,在70 ℃水浴下加熱回流并磁力攪拌,直至溶液變為澄清透明后,室溫下冷卻,于一定溫度下包合一定時間。包合完成后減壓抽濾,濾液于40 ℃回收溶劑后加入2 mL蒸餾水并用2 mol/L HCl調節pH為2~3,加石油醚萃取3次,合并有機相后用溫水洗至溶液呈中性,加入無水硫酸鈉進行脫水,旋轉蒸發回收石油醚,即得較高含量的α-桐酸(產物)。產物收率為富集后α-桐酸質量與混合脂肪酸質量的比值。

1.2.4脂肪酸組成的測定參照GB 5009.168—2016,采用三氟化硼法對樣品進行甲酯化,然后采用GC-MS測定脂肪酸組成。GC條件:HP-88色譜柱(100 m× 0.25 mm×0.20 μm);載氣為99.999%高純氮氣,恒流模式,柱流速1 mL/min;進樣量1 μL,不分流進樣;進樣口溫度250 ℃;升溫程序為150 ℃保持0 min,以4 ℃/min升溫至190 ℃,保持5 min,再以2 ℃/min升溫至230 ℃,保持10 min。MS條件:離子化方式EI+,電子能量70 eV,接口溫度250 ℃,離子源溫度 200 ℃。質譜庫為NIST11.L。采用峰面積歸一化法對各脂肪酸進行定量。

1.2.5α-桐酸純度的計算先將1 mL 5 mg/mL α-桐酸標準品甲酯化。準確吸取1 mL α-桐酸甲酯(α-桐酸質量濃度2.5 mg/mL)于1 mL容量瓶中,作為α-桐酸甲酯標準儲備液。精密量取儲備液0.4、0.2、01、0.05、0.02 mL于1 mL容量瓶中,用正己烷定容,制得系列標準工作溶液,經GC-MS測定后,以峰面積(X)為橫坐標,α-桐酸質量濃度(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得到α-桐酸的標準曲線方程為Y=1.24×10-8X+0.166 5(R2=0.995 3)。根據標準曲線方程以及樣品甲酯化后經GC-MS測定獲得的α-桐酸甲酯峰面積,按下式計算試樣的α-桐酸純度(Y0)。Y0=c×Vm×10-3×100%

(1)式中:c為代入標準曲線計算所得α-桐酸質量濃度,mg/mL;V為甲酯化稀釋體積,mL;m為甲酯化苦瓜籽油質量,g。  

1.2.6數據分析試驗數據采用“平均數±標準差”表示,采用Origin 9.0 作圖。   

2結果與討論

2.1苦瓜籽油的理化指標(見表1)

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由表1可以看出,苦瓜籽油過氧化值相對較高,這與文獻\[13-14\]報道不一致,可能與苦瓜籽油放置時間、苦瓜種類、提取方法有關。另外,苦瓜籽油皂化值較低,可能是因為其含有較多的不皂化物。

 2.2單因素試驗

2.2.1尿素包合溶劑種類對α-桐酸富集的影響在混合脂肪酸與尿素質量比1∶ 4、尿素與溶劑質量比1∶ 4、包合溫度0 ℃、包合時間18 h條件下,考察溶劑(95%甲醇、95%乙醇)對α-桐酸富集效果的影響,結果如圖1所示。

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由圖1可以看出,95%甲醇、95%乙醇作為溶劑時,包合后得到的α-桐酸純度和產物收率差別不大,考慮到95%甲醇作溶劑可能會形成甲酯,甲酯具有一定的毒性\[15\],影響α-桐酸后續在保健品等方面的應用。因此,選擇95%乙醇作溶劑。

2.2.2尿素與溶劑質量比對α-桐酸富集的影響

在95%乙醇作溶劑、混合脂肪酸與尿素質量比1∶ 4、包合溫度0 ℃、包合時間18 h條件下,考察尿素與乙醇質量比對α-桐酸富集效果的影響,結果如圖2所示。由圖2可以看出,α-桐酸純度和產物收率隨著乙醇用量的增加均有較大幅度的提高,α-桐酸純度由29.67%提高到44.21%,產物收率由12.94%提高到26.92%。這是因為乙醇用量的增加會降低混合脂肪酸的濃度,尿素分子可以與脂肪酸充分接觸,單不飽和脂肪酸更容易被尿素包合。此外,受乙醇用量增加的影響,混合脂肪酸的黏度逐漸降低,進一步減少了過濾過程中尿素包合晶體對多不飽和脂肪酸的吸附,從而使得濾液中α-桐酸的純度提高。在尿素與乙醇質量比為1∶ 5時,尿素分子的包合能力即將達到極限,α-桐酸純度和產物收率增加都趨于平緩。因此,選擇尿素與乙醇質量比為1∶ 5。

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2.2.3混合脂肪酸與尿素質量比對α-桐酸富集的影響在95%乙醇作溶劑、尿素與乙醇質量比1∶ 5、包合溫度0 ℃、包合時間18 h條件下,考察混合脂肪酸與尿素質量比對α-桐酸富集效果的影響,結果如圖3所示。

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由圖3可以看出:隨著混合脂肪酸與尿素質量比的增加,α-桐酸的純度逐漸提高,由35.60%提高到50.20%;而產物收率隨混合脂肪酸與尿素質量比的增加從22.66%降低到12.15%。這可能是因為當尿素用量較低時,各脂肪酸之間會相互競爭,尿素無法將單不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸完全包合,因此在濾液中殘留較多未被包合的單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸,使得α-桐酸的純度不高而產物收率較高。但是尿素包合脂肪酸的能力是一定的,尿素用量過多時,剩余的尿素就會與部分多不飽和脂肪酸進行包合,從而導致產物收率降低。此外,多不飽和脂肪酸和尿素分子均具有較強的極性,彼此之間存在相互吸附作用,并能形成氫鍵,在過濾過程中部分多不飽和脂肪酸仍能被尿素吸附。因此,選擇混合脂肪酸與尿素質量比為1∶4。

2.2.4包合時間對α-桐酸富集的影響在95%乙醇作溶劑、尿素與乙醇質量比1∶ 5、混合脂肪酸與尿素質量比1∶ 4、包合溫度0 ℃條件下,考察包合時間對α-桐酸富集效果的影響,結果如圖4所示。

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由圖4可以看出,隨著包合時間的延長,α-桐酸純度先增加后趨于平緩,同時產物收率隨著包合時間的延長而減少。這可能是由于在較短的包合時間內,尿素晶粒生長受到影響,隨著包合時間的延長,尿素與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的包合更加充分,從而使得α-桐酸純度逐漸提高。然而當尿素的晶粒長到一定限度時,繼續包合會導致尿素對多不飽和脂肪酸的包合,從而降低產物收率。因此,選擇包合時間為18 h。

2.2.5包合溫度對α-桐酸富集的影響在95%乙醇作溶劑、尿素與乙醇質量比1∶ 5、混合脂肪酸與尿素質量比1∶ 4、包合時間18 h條件下,考察包合溫度對α-桐酸富集效果的影響,結果如圖5所示。

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由圖5可以看出:隨包合溫度的升高,α-桐酸純度呈下降趨勢,這是因為尿素包合過程是一個放熱的過程,較低的溫度能夠促進包合物生成,提高產物純度\[16\];但是在包合溫度過低時,尿素與脂肪酸包合速率過快,反應體系在未包合完全的情況下就已經凝結,使得后期過濾困難,導致產物收率偏低,隨著包合溫度的升高,多不飽和脂肪酸在乙醇中的溶解度提高,使產物收率升高。然而包合溫度升高,脂肪酸與尿素的結合并不穩固,包合物晶體之間分布較為松散,飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸很容易與尿素脫離,從而使α-桐酸純度下降。包合溫度為0 ℃時,α-桐酸純度和產物收率都較高。因此,選擇包合溫度為0 ℃。

2.3正交試驗

在單因素試驗基礎上,固定95%乙醇作為尿素溶劑,尿素與乙醇質量比1∶ 5,以混合脂肪酸與尿素質量比、包合時間、包合溫度為因素,α-桐酸純度為指標,設計三因素三水平的正交試驗優化α-桐酸富集工藝。正交試驗因素水平見表2,正交試驗設計及結果見表3。

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由表3可以看出,各因素對α-桐酸富集的影響主次順序為A>C>B,即混合脂肪酸與尿素質量比的影響最大,其次是包合溫度、包合時間。最佳工藝組合為A1B3C3,即選擇95%乙醇為尿素溶劑,尿素與乙醇質量比1∶ 5,混合脂肪酸與尿素質量比1∶ 3,包合溫度4 ℃,包合時間24 h。在最佳條件下,α-桐酸純度為60.03%,產物收率為33.94%。

2.4尿素包合前后脂肪酸組成(見表4)

由表4可知:苦瓜籽油中共檢出8種脂肪酸,與張飛等\[14\]的研究結果相似;飽和脂肪酸有3種,不飽和脂肪酸有5種,其中共軛亞麻酸包括α-桐酸及其兩種順反異構體CLN-B、CLN-C,與文獻\[14,17-18\]所測的苦瓜籽油含有高不飽和脂肪酸結果相同。富集前苦瓜籽油中主要的脂肪酸是硬脂酸和α-桐酸,相對含量分別為37.64%、32.97%,富集后,硬脂酸相對含量減少至16.10%,而α-桐酸相對含量增加至53.94%,此時α-桐酸純度為60.03%,較苦瓜籽油中的28.83%顯著提高;共軛亞麻酸相對含量達到71.28%,比富集前增加了1965百分點。因此,尿素包合法可用于富集苦瓜籽油中的α-桐酸。

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3結論

以超臨界CO2萃取的苦瓜籽油為原料,采用尿素包合法富集苦瓜籽油中的α-桐酸。通過單因素試驗和正交試驗,確定最佳富集工藝條件為:以95%乙醇為尿素溶劑,苦瓜籽油混合脂肪酸與尿素質量比1∶ 3,尿素與乙醇質量比1∶ 5,包合溫度4 ℃,包合時間24 h。在最佳條件下,α-桐酸純度為6003%,產物收率為33.94%,α-桐酸相對含量為53.94%,共軛亞麻酸相對含量達到71.28%。
     

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