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中華草龜內臟油的水酶法提取及其不同部位脂質組成分析

發布日期:2022-04-07 16:07來源:中國油脂作者:郭曉璐等。(lkm點擊次數:

中華草龜,又稱烏龜、金龜等,主要分布在中國、韓國、日本等亞洲部分地區[1-2],由于其適應性強、易繁育、壽命長,經常被用作食品和中藥材,具有很高的經濟價值[3-4]。中華草龜富含多種營養物質,龜肉的粗蛋白質中至少包含17種氨基酸,龜肉的脂肪中富含不飽和脂肪酸。據報道,龜蛋白肽具有多種醫療作用,可以被用作抗氧化劑和抗腫瘤劑等[5]。龜甲是一味名貴的中藥,其主要含膠質、角蛋白、脂肪、鈣鹽等多種營養成分[6]。目前,隨著龜鱉養殖業規模的不斷擴大,除了對龜甲、龜肉等有經濟價值部位的傳統利用外,其他部位利用率不高,大多被丟棄,在某種程度上造成資源浪費且污染環境[7]。龜鱉副產物中含有許多重要的營養成分,如蛋白質、脂類等,尤其是脂類中不飽和脂肪酸含量豐富[8]。因此,對龜鱉副產物中油脂的提取和利用有助于提高龜鱉資源的綜合利用率和商業價值。近年來,水酶法因安全、環保、設備要求低等優點[9-10]被廣泛應用于植物種子中油脂的提取[11-15],而目前還未見利用水酶法提取中華草龜內臟油(Chinemys Reevesiis viscera oil,CRVO)的相關研究報道。水酶法中酶的種類與添加量、酶解溫度、pH、酶解時間等因素均會顯著影響提油率[16-17]。因此,有必要探索從龜鱉副產物中高效提油的水酶法條件。通過超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質譜法(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)能夠對脂質組成進行定性和定量分析,全面了解其營養價值并加以利用,并因其鑒定不同脂質的可靠性,以及不同組分的高效率分離和離子抑制效果小等優點而被廣泛應用[18-20]。如Zhang等[21]利用此方法分析鮑魚不同部位的脂質組成,共鑒定出10種類型,其中包括34種脂質成分,如磷脂酰膽堿(PC)、甘油三酯(TAG)等。針對中華草龜副產物,本文采用單因素實驗優化了水酶法提取中華草龜內臟油的工藝條件;同時,通過氣相色譜-質譜(GC-MS)和UPLC-ESI-Q-TOF-MS對中華草龜不同部位的脂質進行全面的分析和評價,為有效提高中華草龜副產物的綜合利用,延長產業鏈以及增加龜鱉產業的附加值提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

中華草龜,安徽藍田龜鱉有限公司。堿性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶,美國Sigma公司;甲醇、乙酸銨,均為色譜純,大連博諾有限公司;其他試劑均為分析純。Agilent 7890A/5975C氣相色譜質譜聯用儀,美國Agilent公司;超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質譜聯用儀,德國Bruker公司。

1.2實驗方法

1.2.1水酶法提取中華草龜內臟油

取中華草龜內臟,洗凈、凍干、粉碎并真空包裝,置于-4 ℃冷藏,并在7 d內使用。稱取一定量中華草龜內臟凍干粉,添加一定量的純凈水和蛋白酶,調節至設定的溫度和pH,在旋轉水浴中磁力攪拌酶解一定時間后,95 ℃水浴10 min滅酶;取出并在7 800 g離心10 min,用膠頭滴管吸出上層油相,烘干至恒重并記錄其質量。按下式計算提油率(Y)。Y=ma/mb×100%

(1)式中:ma為中華草龜內臟油的質量,g;mb為原料的質量,g。

1.2.2脂質的提取采用Folch法[22]從中華草龜4個部位(肌肉、內臟、脂肪塊、卵)提取脂質。

1.2.3脂質脂肪酸組成分析分別精確稱量提取的脂質0.1 g,加入2.5 mL KOH溶液(500 g/L)和5 mL乙醇(95%),在60 ℃磁力攪拌下加熱2 h進行皂化,然后冷卻到室溫用吸管吸走上層不皂化物,用3 mL正己烷洗滌下層液體6次,然后用6 mol/L HCl將下層液體pH調至20,再用3 mL正己烷重復提取脂肪酸;用去離子水洗滌正己烷提取物至中性,然后用吸管吸走下層水相,保留上層有機相,氮吹干燥。加入正己烷使其質量濃度為10 mg/mL,再加入2.0 mL甲基化試劑(含1% H2SO4的色譜級甲醇)。在70 ℃水浴中磁力攪拌1 h,隨后冷卻至室溫并加入1 mL去離子水;靜置收集上層,過無水硫酸鈉后,過0.22 μm有機濾膜,進氣相色譜質譜(GC-MS)聯用儀進行分析,GC-MS分析條件見文獻[23]。

1.2.4脂質組成的測定取一定量提取的脂質溶于氯仿-甲醇(體積比1∶ 5)中,配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液,再用流動相B稀釋到200 μg/mL,過0.22 μm有機濾膜,待UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析[21]。UPLC條件:Waters ACQUITY UPLC BEH C8柱(21 mm×100 mm,1.7 μm);流動相A為超純水,流動相B為甲醇-異丙醇 (體積比85∶ 15) ,流動相A、B中均含有0.1%的乙酸和10 mmol的乙酸銨;洗脫梯度為0~1 min 70% B,1~6 min 70%~75% B,6~10 min 75%~85% B,10~15 min 85%~88% B,15~32 min 88%~99.9% B,32~33 min 99.9%~75% B,33~35 min 75% B;流速0.4 mL/min;柱溫50 ℃;進樣量5 μL。MS條件:采用正離子模式,質量掃描范圍(m/z)50~1 500,脫溶劑氣流量8 L/min,溶劑溫度200 ℃,噴霧器壓力0.2 MPa,毛細管電壓4 500 V,總循環時間1.2~1.8 s。儀器通過ESI-L低濃度調諧混合物進行校準。

 1.2.5脂質種類的鑒別和定量通過Bruker Q-TOF MS 系統采集數據,用甲酸鈉校準曲線校準脂質的相對分子質量。采用開源軟件MS-DIAL通過去卷積對小分子進行定性和定量,并且得到準確的相對分子質量信息。通過分析保留時間、質量精度和二級質譜與譜庫(HMDB,ChEBI,FooDB)的匹配度最終實現脂質種類的鑒別。采用面積歸一化法確定脂質的相對含量。通過序列方法對不同的樣品、不同的平行樣調整保留時間和質荷比偏差。

 1.2.6數據分析所有實驗均重復3次,結果以“平均值±標準差”表示。采用Origin9.5和SPSS16.0對實驗數據進行統計分析。其中主成分分析(PCA)采用SIMCA 13.0進行統計。樣品平均值之間的差異性使用Duncan法比較(P<0.05)。

2結果與討論

2.1水酶法提取中華草龜內臟油的單因素實驗

2.1.1 酶的種類和酶解時間對提油率的影響

固定料液比1∶ 4、酶添加量0.5%(以中華草龜內臟粉質量計,下同)、酶解溫度55 ℃和pH 7,選用4種商業酶,按1.2.1方法提取中華草龜內臟油,考察酶種類和酶解時間對中華草龜內臟提油率的影響,結果見圖1。由圖1可以看出,隨著酶解時間的延長,4種蛋白酶的提油率均先增大后減小,堿性蛋白酶和風味蛋白酶在酶解1.0 h時提油率達到最大,分別為(66.12±0.74)%和(64.29±070)%。而復合蛋白酶和中性蛋白酶的提油率在酶解2.0 h達到最大,分別為(62.76±0.44)%和(67.06±113)%。這可能與不同類型和來源的酶對蛋白質的水解作用不同有關。酶解時間在影響提油率的同時,還影響油品的品質,長時間加熱攪拌,可能會引起油品的氧化導致其品質降低。因此,綜合考慮,選擇堿性蛋白酶對中華草龜內臟油進行酶解提取,酶解時間為0.5 h。

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2.1.2酶添加量、酶解溫度、pH和料液比對提油率的影響在使用堿性蛋白酶、酶解時間0.5 h的條件下,采用水酶法提取中華草龜內臟油,考察酶添加量、酶解溫度、pH和料液比對中華草龜內臟提油率的影響,結果見圖2。由圖2(a)可看出,隨著酶添加量的增加,提油率先增加后降低,在酶添加量為0.5%時,提油率最大。當酶添加量低時,酶量不夠導致提油率低;而當酶添加量增加時,酶逐漸過量,且酶與底物結合形成的復合物對酶形成反饋抑制作用,導致反應速率降低[24],提油率降低。綜合考慮,選擇酶添加量為0.5%。從圖2(b)、(c)可看出,隨著酶解溫度的升高和pH的增加,提油率呈明顯的先上升后下降趨勢,在55℃和pH 7時對中華草龜內臟油的提取效果最佳。由圖2(d)可看出,料液比在1∶4時提油率最高,為63.56%,料液比過高和過低對提油率均有不利的影響,因為在料液比過高時存在稀釋效應,在料液比過低時存在低流動性。綜合考慮,確定水酶法提取中華草龜內臟油的最優工藝條件為:選用堿性蛋白酶,酶解時間0.5 h,酶添加量0.5%,酶解溫度55℃,pH 7和料液比1∶4。在最優工藝條件下,經驗證實驗提油率為(66.56±1.25)%。

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2.2不同部位脂質脂肪酸組成(見表1)

由表1可看出:中華草龜肌肉、內臟、脂肪塊和卵脂質中共檢出包括同分異構體在內的16種脂肪酸,其中C18∶ 1n-9的含量最高,占4個部位脂質中總脂肪酸的43.39%~50.66%;另外,含量相對較高的脂肪酸還有C16∶0(14.87%~20.82%)和C18∶2n-6(1378%~17.40%),同時還檢出一定量的二十碳五烯酸(EPA)(0.29%~0.60%)和二十二碳六烯酸(DHA)(0.36%~0.53%)。DHA和EPA是兩類重要的脂肪酸,有助于嬰兒的大腦發育,并具有抗癌、抗炎和抗衰老等功效。中華草龜4個部位脂質中飽和脂肪酸含量為20.38%~29.53%,單不飽和脂肪酸含量為53.64%~64.57%,多不飽和脂肪酸含量為15.06%~18.16%。中華草龜脂質的不飽和脂肪酸含量(70.49%~79.62%)較高,接近鱒魚魚油(726%~75.3%)[25]。

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2.3不同部位脂質組成按

1.2.4方法對中華草龜卵、內臟、肌肉和脂肪塊的脂質組成進行UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析,結果發現,所有脂質在25 min內溢出,并且甘三酯(TAG)主要在20~25 min被分離出來,而少量的鞘磷脂(SM)、磷脂(PC)和甘二酯(DAG)主要在7~14 min被分離出來,且TAG的種類和含量較多,而SM、PC和DAG種類和含量很少。圖3為通過正離子模式超高效液相色譜分離質控樣的質譜解卷積譜圖。

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經MS-DIAL 和MS-FINFER分析,中華草龜卵、內臟、肌肉和脂肪塊脂質中共檢測到139種成分,包括4種DAG、7種磷脂PC、3種SM和125種TAG,通過正離子模式,PC和SM以[M+H]+加和離子的形式被檢出,DAG主要以[M+NH4]+或[M+H]+的形式被檢出,TAG主要以[M+H]+、[M+NH4]+或[M+Na]+的形式被檢出。這些H+、NH+4、Na+可能來自樣品、流動相或儀器中。中華草龜不同部位脂質類別的相對含量見表2。由表2可看出,從中華草龜4個不同部位提取的脂質主要成分均為TAG,在卵、內臟、肌肉和脂肪塊脂質中的相對含量分別為96.41%、99.43%、9876%和99.46%。中華草龜卵脂質中的PC含量最豐富,高達278%;而在脂肪塊和內臟脂質中,PC含量極少,這可能是由于這兩個部位中的細胞外脂質含量較高,來自細胞膜或其他部分的脂質含量低。

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表3為中華草龜卵、內臟、肌肉和脂肪塊脂質中主要的TAG、DAG、PC和SM 組成和相對含量。

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 2.4脂質主成分分析

圖4為中華草龜不同部位脂質之間相關性的PCA結果。由圖4(a)可看出,主成分1(82%)和主成分2(9%)的累積得分為91%,表明兩個成分可以較好地代表整體數據。內臟脂質和脂肪塊脂質形成一簇,表明這兩個部位的脂質組成相似,而與卵和肌肉的脂質組成不同。結合圖4(b)可以發現:PC(14∶0/21∶1)獨立于其他物質之外,并且沿著與卵脂質簇矢量方向一致,表明卵脂質中該物質的含量較高;TAG(16∶1/18∶1/18∶2)、TAG(18∶ 2/18∶ 2/18∶ 2)和TAG(18∶1/18∶2/18∶2)形成簇并且其矢量方向表明這些物質在肌肉脂質中含量高于其他物質;TAG(16∶ 0/16∶ 0/18∶1)、TAG(16∶0/18∶1/18∶1)和TAG(18∶ 0/18∶ 1/18∶ 1)形成一簇且矢量方向指向內臟和脂肪塊脂質,表明在內臟和脂肪塊脂質中這些物質的含量較高。

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3結論

本文首先采用單因素實驗優化得到水酶法提取中華草龜內臟油的工藝條件,即以堿性蛋白酶為酶解用酶、酶解時間0.5 h、酶添加量0.5%、酶解溫度55℃、pH 7和料液比1∶4,在此條件下提油率為(66.56±1.25)%。其次,分別采用GC-MS 和UPLC-ESI-Q-TOF-MS對中華草龜卵、內臟、肌肉和脂肪塊脂質的脂肪酸和脂質組成進行分析,結果表明,不同部位的脂質中不飽和脂肪酸含量均較高,并含有一定量的DHA和EPA。主要脂質種類為TAG,同時含有少量DAG、PC和SM。PCA結果表明,脂肪塊和內臟中的脂質成分相似,但與卵和肌肉脂質組成明顯不同。本研究通過對中華草龜脂質的全面分析發現,龜鱉副產物具有作為食用油脂開發的潛力。
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